用于甲基化检测的样本前处理试剂盒及前处理方法技术

本发明专利技术涉及一种用于甲基化检测的样本前处理试剂盒及前处理方法，试剂盒包括转化溶液、结合缓冲液、洗涤溶液、去磺化溶液、洗脱溶液、磁珠；其中，转化溶液包括：0.1~0.7M亚硫酸氢钠、0.1~1.2M亚硫酸镁、3~15M亚硫酸氢铵、0.05~0.5M亚硫酸铵、0.05~0.5M对苯二酚、0.01~0.5M DETA、0.1~2M四氢糠醇、1~4mM TEPA、灭菌水。本发明专利技术在亚硫酸盐转化溶液中加入保护成分，减少DNA转化过程中的降解量，大幅度提高转化后的DNA浓度，提高转化效率，进而降低了检测的成本，同时提高了PCR及后续分析技术的灵敏度，进而提高检测结果的准确性。进而提高检测结果的准确性。进而提高检测结果的准确性。

【技术实现步骤摘要】
用于甲基化检测的样本前处理试剂盒及前处理方法


[0001]本专利技术涉及一种用于甲基化检测的样本前处理试剂盒及前处理方法，适用于基因检测


技术介绍

[0002]DNA甲基化(DNAmethvlation)为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究说明，DNA甲基化能引起染色质结构，DNA构象，DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化修饰研究手段：DNA亚硫酸盐转化，是使用亚硫酸氢钠将胞嘧啶转化为尿嘧啶，而5
‑
甲基胞嘧啶（5
‑
mC）保持完整，即未甲基化的胞嘧啶残基被脱氨成尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶(5
‑
mC)残基不受影响，这使PCR扩增可将尿嘧啶视为胸腺嘧啶，将5
‑
mC或5
‑
hmC识别为胞嘧啶。这样便能够区分甲基化和未甲基化的胞嘧啶残基，从而提供有关DNA甲基化区域的单核苷酸分辨率信息。
[0003]然而，由于重亚硫酸盐转化DNA的化学反响过于剧烈，转换过程中的酸性物质会破坏DNA，造成大量DNA降解，降低DNA的转化率，不仅会增大DNA甲基化检测的成本，还会降低PCR（Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应）及后续分析技术的灵敏度，影响检测结果的准确性。

技术实现思路

[0004]为了解决上述现有技术存在的缺陷，本专利技术提出了一种用于甲基化检测的样本前处理试剂盒及前处理方法。本专利技术采用的技术方案是：一方面，本专利技术提出了一种用于甲基化检测的样本前处理试剂盒，包括转化溶液、结合缓冲液、洗涤溶液、去磺化溶液、洗脱溶液、磁珠；其中，转化溶液包括以下组分：0.1~0.7M亚硫酸氢钠、0.1~1.2M亚硫酸镁、3~15M亚硫酸氢铵、0.05~0.5M亚硫酸铵、0.05~0.5M对苯二酚、0.01~0.5M DETA、0.1~2M四氢糠醇、1~4mM TEPA 、灭菌水；其中，对苯二酚、DETA、四氢糠醇、TEPA作为保护剂添加入转化溶液，可降低DNA的降解量，提高转化率。
[0005]进一步地，结合缓冲液包括以下组分：1~15M盐酸胍、5~20mM Tris、0.1～0.5％(V/V)冰醋酸、灭菌水。
[0006]进一步地，洗涤溶液包括以下组分：无水乙醇、灭菌水。
[0007]进一步地，去磺化溶液包括以下组分：5~20％ 50%无菌甘油、0.1~1M氢氧化钠、5~20mM氯化钠、无水乙醇、灭菌水。
[0008]进一步地，洗脱溶液包括以下组分：5~20mM Tris、0.05~0.2mM EDTA、灭菌水。
[0009]进一步地，磁珠为羟基磁珠，粒径为400~600nm。
[0010]另一方面，本专利技术还提出了一种用于甲基化检测的样本前处理方法，采用了上述用于甲基化检测的样本前处理试剂盒，该前处理方法包括：
S1、向含有5~40μL DNA样本的PCR管中加入100~200μL转化溶液，混匀后瞬时离心 ，然后将PCR管置于PCR仪上进行反应，得到第一产物；具体的，将PCR管置于PCR仪上进行反应的反应条件为：在95~101℃温度下反应2~8分钟，然后在54~62℃温度下反应30~80分钟，得到第一产物后将其置于3~5℃温度下保存；S2、向离心管中加入10~30μL振荡混匀后的磁珠 、400~800μL结合缓冲液，涡旋振荡混匀；S3、将第一产物加入离心管中，涡旋振荡混匀后，在室温下放置1~5 分钟，再将离心管放至磁力架上磁吸2~8分钟，然后吸弃上清；S4、将离心管取下，向离心管中加入80~200μL洗涤溶液，涡旋振荡后瞬时离心，再将离心管放至磁力架上磁吸1~5分钟，然后吸弃上清；S5、将离心管取下，向离心管中加入100~300μL去磺化溶液，涡旋振荡后，在室温下孵育10~15分钟，再将离心管放置在磁力架上磁吸1~5分钟，然后吸弃上清；S6、将离心管取下，向离心管中加入150~300μL洗涤溶液，涡旋振荡混匀，再将离心管放置在磁力架上磁吸1~5分钟，然后吸弃上清，随后重复一次当前步骤；S7、将离心管取下，并将离心管内剩余液体全部吸弃，然后打开盖子，令离心管中的磁珠在室温下晾干 ；S8、向离心管中加入5~25μL提前预热的洗脱溶液，涡旋振荡，并孵育1~10分钟，再将离心管放置在磁力架上磁吸1~10分钟，吸取上清后即得到所需的DNA样本；具体的，预热洗脱溶液的方法为：采用50~62℃的金属浴加热。
[0011]由于上述技术方案运用，本专利技术相较现有技术具有以下优点：本专利技术的用于甲基化检测的样本前处理试剂盒及前处理方法，通过在转化溶液中添加的保护剂，大幅度提高转化后的DNA浓度，提高转化率，进而降低了检测的成本，同时提高了PCR及后续分析技术的灵敏度，进而提高检测结果的准确性。
附图说明
[0012]后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本专利技术的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的组件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：图1是本专利技术中实施例1~3的DNA回收率表图；图2是本专利技术中对比例1~5的DNA回收率表图；图3是本专利技术中实施例1~3、对比例1~5的DNA回收率对比图；图4是本专利技术中实施例1~3转化后产物的直接测序结构图；图5是本专利技术中实施例1~3转化后产物的荧光曲线测试图。
实施方式
[0013]下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0014]此外，下面所描述的本专利技术不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构
成冲突就可以相互结合。
实施例
[0015]本实施例提供了一种用于甲基化检测的样本前处理试剂盒，包括转化溶液、结合缓冲液、洗涤溶液、去磺化溶液、洗脱溶液、磁珠；其中，转化溶液包括以下组分：0.1M亚硫酸氢钠、0.1M亚硫酸镁、3M亚硫酸氢铵、0.05M亚硫酸铵、0.05M对苯二酚、0.01M DETA、0.1M四氢糠醇、1mM TEPA 、灭菌水；其中，对苯二酚、DETA、四氢糠醇、TEPA作为保护剂添加入转化溶液，可降低DNA的降解量，提高转化率。结合缓冲液包括以下组分：1M盐酸胍、5mM Tris、0.1％(V/V)冰醋酸、灭菌水；洗涤溶液包括以下组分：无水乙醇、灭菌水；去磺化溶液包括以下组分：5％ 50%无菌甘油、0.1M氢氧化钠、5mM氯化钠、无水乙醇、灭菌水；洗脱溶液包括以下组分：5mM Tris、0.05mM EDTA、灭菌水；磁珠为400nm羟基磁珠。具体的，上述各溶液中灭菌水的添加量以能够满足溶液中其余组分浓度要求的剂量为准。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于甲基化检测的样本前处理试剂盒，其特征在于，包括转化溶液、结合缓冲液、洗涤溶液、去磺化溶液、洗脱溶液、磁珠；其中，所述转化溶液包括以下组分：0.1~0.7M亚硫酸氢钠、0.1~1.2M亚硫酸镁、3~15M亚硫酸氢铵、0.05~0.5M亚硫酸铵、0.05~0.5M对苯二酚、0.01~0.5M DETA、0.1~2M四氢糠醇、1~4mM TEPA、灭菌水。2.根据权利要求1所述的用于甲基化检测的样本前处理试剂盒，其特征在于，所述结合缓冲液包括以下组分：1~15M盐酸胍、5~20mM Tris、0.1～0.5％(V/V)冰醋酸、灭菌水。3.根据权利要求1所述的用于甲基化检测的样本前处理试剂盒，其特征在于，所述洗涤溶液包括以下组分：无水乙醇、灭菌水。4.根据权利要求1所述的用于甲基化检测的样本前处理试剂盒，其特征在于，所述去磺化溶液包括以下组分：5~20％50%无菌甘油、0.1~1M氢氧化钠、5~20mM氯化钠、无水乙醇、灭菌水。5.根据权利要求1所述的用于甲基化检测的样本前处理试剂盒，其特征在于，所述洗脱溶液包括以下组分：5~20mMTris、0.05~0.2mMEDTA、灭菌水。6.根据权利要求1所述的用于甲基化检测的样本前处理试剂盒，其特征在于，所述磁珠为羟基磁珠，粒径为400~600nm。7.一种用于甲基化检测的样本前处理方法，其特征在于，采用权利要求1~6中任一项所述的用于甲基化检测的样本前处理试剂盒，该前处理方法包括：S1、向含有5~40μL DNA样本的PCR管中加入100~200μL转化溶液，混匀后瞬时离心，然后将所述PCR管置于PCR仪上进行反应，得到第一产物...

【专利技术属性】
技术研发人员：王景，肖宇清，范贝贝，杨笑笑，张若寒，汪强虎，
申请(专利权)人：昂凯生命科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：