基于核壳纳米组装结构的SERS适配体传感器及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于核壳纳米组装结构的SERS适配体传感器及其制备方法，及其在多元真菌毒素检测中的应用。本发明专利技术将巯基标记的真菌毒素AFB1和OTA的DNA适配体等比例同时修饰到核壳纳米棒表面，将与适配体互补DNA和不同染料分子修饰的两种金纳米粒子作为SERS纳米探针。AFB1和OTA真菌毒素分子、SERS纳米探针与金银核壳纳米棒结构表面的适配体竞争结合，对核壳纳米组装结构产生影响。真菌毒素的浓度对数与SERS信号呈负相关，由此建立可同时多元检测食品中黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)的SERS适配体传感器，具有操作简单、灵敏度高等特点。度高等特点。度高等特点。

【技术实现步骤摘要】
基于核壳纳米组装结构的SERS适配体传感器及其制备与应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种基于核壳纳米组装结构的SERS适配体传感器及其制备方法，及其在多元真菌毒素检测中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]真菌毒素是由多种真菌产生的次级代谢产物，会污染多种农产品和食品。它们中的大多数都表现出对人和动物的免疫毒性、致癌性、致畸性和致突变性等广泛的毒性作用。食用受真菌毒素污染的食品会对人体健康造成严重威胁。迄今为止，全世界已鉴定出400多种真菌毒素。其中，最常见和有毒的真菌毒素是黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)。由于这些真菌毒素毒性强且毒性多样，许多国家和地区都制定了严格的真菌毒素最大残留限量。但令人担忧的是，世界范围内越来越多地观察到多种真菌毒素的污染。据报道，从世界范围内收集的30～100％的食品、饲料原料和全饲料原料被多种类型的真菌毒素共同污染。感染一种产真菌毒素的真菌菌株会产生不止一种类型的真菌毒素，样品中同时污染了几种真菌，以及由多种受污染成分组成的完整产品。此外，多种真菌毒素通常同时出现在一个样品中，可能通过累加和协同效应导致毒性增加。
[0003]目前，预防食物链中真菌毒素污染的有效方法是开发快速、灵敏且具有成本效益的多元检测方法。色谱技术包括气相色谱和高效液相色谱以及它们与各种质谱技术的结合是最常用的同时检测多种真菌毒素的方法。虽然色谱法对霉菌毒素的分析显示出高灵敏度、高准确度和良好的重现性，但存在费时、高成本、需要训练有素的人员和复杂的预处理程序，不适合在大量样品中快速现场筛查多种真菌毒素。酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种常见的适用于食品安全快速筛查的检测技术，但真菌毒素的高性能抗体，如针对AFB1和OTA的高性能单克隆抗体的成本较高，这使得该方法相对昂贵，且抗体的稳定性等方面仍存在局限。
[0004]表面增强拉曼散射光谱(SERS)是一种有效的分析检测技术，具有高灵敏度和高选择性等优点，仅需要微量样品，并且不需要严格的实验条件，这为真菌毒素的检测开辟了新的视野。其中以金属纳米粒子组装体为SERS基底时，由于其相邻粒子的间隙具有巨大的电磁场增强，具有明显优势。随着新型纳米材料的发展，异质结构如核壳纳米结构(金银核壳纳米粒子、纳米棒等)受到越来越多的关注。核酸适配体是一小段经体外筛选得到的单链DNA或RNA寡核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。相比较抗体检测，适配体的筛选易于体外大量合成，重复性好、稳定性高且易于贮存。目前，AFB1和OTA的核酸适配体具有很好的选择性，相关检测应用已有非常多的相关报道。
[0005]中国专利201910282105.3公开了一种赭曲霉毒素A的SERS检测方法，利用，用巯基乙酸修饰的金纳米粒子作为SERS基底，将OTA拉进金纳米粒子的局域电磁场增强区，直接利用OTA的SERS特征峰对其进行定量的分析方法。但是单纯依赖SERS技术一般特异性较差，需要二次利用化学计量学方法或建立模型进行判别和鉴定，且该方法无法直接应用于其他真菌毒素的检测。中国专利201710119657.4公开了一种基于DTNB标记的金@银核壳纳米棒的
真菌毒素超灵敏检测方法，利用核壳纳米棒和真菌毒素适配体修饰的壳聚糖四氧化三铁磁珠，构建了三明治结构的检测体系。适配体的特异性和磁性材料的分离聚集作用可以拉近增强基底和待测物距离，核壳结构提高了拉曼信号，但是该专利对于多种真菌毒素的同时多元检测并没有涉及。
(三)
技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种基于核壳纳米组装结构的SERS适配体传感器，以实现多种真菌毒素包括黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)的同时多元检测，且灵敏度高。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种基于核壳纳米组装结构的SERS适配体传感器，由如下方法制备获得：首先制备金银核壳纳米棒结构，再将巯基标记的真菌毒素AFB1和OTA的DNA适配体等比例同时修饰到核壳纳米棒表面，并将与适配体互补DNA和不同染料分子修饰的两种金纳米粒子作为SERS纳米探针。
[0009]其中，AFB1适配体序列为：5
’‑
SH
‑
(CH2)6‑
TCGAGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTG TGTCTCGTGCCCTTCAGGCCCACA
‑3’
，OTA适配体序列为：5
’‑
SH
‑
(CH2)6‑
TCGACTCTCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA
‑3’
；与AFB1适配体互补的DNA序列为：5
’‑
NH2‑
(CH2)6‑
CCTGAAGGGCAC
‑3’
；与OTA适配体互补的DNA序列为：5
’‑
NH2‑
(CH2)6‑
ATGCACCC T CGCC
‑3’
[0010]本专利技术制备了金银核壳纳米棒结构，并将巯基标记的真菌毒素AFB1和OTA的DNA适配体等比例同时修饰到核壳纳米棒表面，将与适配体互补DNA和不同染料分子修饰的两种金纳米粒子作为SERS纳米探针。AFB1和OTA目标真菌毒素、SERS纳米探针与金银核壳纳米棒结构表面的AFB1和OTA适配体竞争结合，对核壳纳米组装结构产生影响。两种真菌毒素的浓度与SERS信号呈负相关，由此可建立SERS传感器实现多元检测。
[0011]本专利技术还涉及制备所述SERS适配体传感器的方法，所述方法包括：
[0012](1)金银核壳纳米棒的制备；
[0013](2)适配体修饰的金银核壳纳米棒制备：
[0014](a)巯基修饰的AFB1和OTA适配体与新鲜配制的TCEP溶液混合并在室温下静置1～2h，活化DNA末端的巯基；
[0015](b)将TBE缓冲液的pH调整至3.0
±
0.2，然后将新鲜制备纯化的金银核壳纳米棒以及活化后适配体按比例添加到缓冲液中；
[0016](c)混匀并振动10～20min，离心并重悬于Tris
‑
HCl缓冲液中；
[0017](3)互补DNA修饰的SERS纳米探针的制备：
[0018](a)在金纳米粒子溶液中将5,5'
‑
二硫代
‑
双(硝基苯甲酸)或4
‑
巯基苯甲酸溶液添加到并剧烈搅拌20～30min，然后加入SH
‑
PEG
‑
COOH并搅拌；
[0019](b)向混合物中加入MPEG
‑
SH并搅拌，将混合物离心纯化并重悬在Tris
‑
EDTA缓冲溶液中；
[0020](c)在室温下用EDC/NHS溶液活化，离心并将沉淀物重新悬浮在TE缓冲溶液中；
[0021](d)将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于核壳纳米组装结构的SERS适配体传感器，由如下方法制备获得：首先制备金银核壳纳米棒结构，再将巯基标记的真菌毒素AFB1和OTA的DNA适配体等比例同时修饰到核壳纳米棒表面，并将与适配体互补DNA和不同染料分子修饰的两种金纳米粒子作为SERS纳米探针。2.如权利要求1所述的SERS适配体传感器，其特征在于：AFB1适配体序列为：5
’‑
SH
‑
(CH2)6‑
TCGAG TTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCAGGCCCACA
‑3’
，OTA适配体序列为：5
’‑
SH
‑
(CH2)6‑
TCGACTCTCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA
‑3’
；与AFB1适配体互补的DNA序列为：5
’‑
NH2‑
(CH2)6‑
CCTGA AGGGCAC
‑3’
；与OTA适配体互补的DNA序列为：5
’‑
NH2‑
(CH2)6‑
ATGCACCCTCGCC
‑3’
。3.制备权利要求1所述SERS适配体传感器的方法，所述方法包括：(1)金银核壳纳米棒的制备；(2)适配体修饰的金银核壳纳米棒制备：(a)巯基修饰的AFB1和OTA适配体与新鲜配制的TCEP溶液混合并在室温下静置1～2h，活化DNA末端的巯基；(b)将TBE缓冲液的pH调整至3.0
±
0.2，然后将新鲜制备纯化的金银核壳纳米棒以及活化后适配体按比例添加到缓冲液中；(c)混匀并振动10～20min，离心并重悬于Tris
‑
HCl缓冲液中；(3)互补DNA修饰的SERS纳米探针的制备：(a)在金纳米粒子溶液中将5,5'
‑
二硫代
‑
双(硝基苯甲酸)或4
‑
巯基苯甲酸溶液添加到并剧烈搅拌20～30min，然后加入SH
‑
PEG
‑
COOH并搅拌；(b)向混合物中加入MPEG
‑
SH并搅拌，将混合物离心纯化并重悬在Tris
‑
EDTA缓冲溶液中；(c)在室温下用EDC/NHS溶液活化，离心并将沉淀物重新悬浮在TE缓冲溶液中；(d)将与适配体互补的两种DNA溶液分别加入上述金纳米粒子溶液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐霞，刘鑫，王心雨，
申请(专利权)人：宁海县浙工大科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：