细胞核CNV的检测试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了细胞核CNV的检测试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。所述试剂盒通过检测细胞核CNV的异常来判定是否为肿瘤。所述细胞核CNV的检测试剂包括：细胞核DNA提取试剂，细胞核DNA建库测序试剂、细胞核CNV分析系统；还进一步包括细胞膜裂解试剂和细胞核富集装置。细胞核CNV分析系统通过软件对细胞核DNA的测序数据进行分析处理，获得细胞核CNV数据。本发明专利技术通过实验发现：细胞核CNV的检测可以用来区分膀胱癌患者与膀胱良性病变患者，并且相对于尿脱落细胞的CNV检测，针对细胞核的CNV检测对于肿瘤诊断具有更高的准确性。于肿瘤诊断具有更高的准确性。于肿瘤诊断具有更高的准确性。

【技术实现步骤摘要】
细胞核CNV的检测试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用


[0001]本专利技术属于生物医学诊断
，具体涉及细胞核CNV的检测试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。

技术介绍

[0002]癌症是20世纪最可怕的疾病之一，并在21世纪继续蔓延，发病率不断上升。恶性肿瘤细胞之间是存在异质性的，并表现出不同的生物学特性，这些特性通常是由遗传不稳定性引起的。这种异质性包括功能(多型性)和结构(多型性)的变化。在结构改变中，肿瘤细胞最常见的是核大小和形状、染色质组织、核仁大小和数量以及核仁周围空间的改变。其中细胞核大小的变化一直被细胞病理学家作为一个重要的参数。因此，基于细胞核大小对正常细胞以及肿瘤细胞进行区分，可有效的实现肿瘤细胞基因组信息的获取。
[0003]众所周知，癌症是一种基因组疾病，癌症感兴趣的基因组畸变大多是体细胞畸变，因为肿瘤产生于正常细胞，其基因组获得性畸变。拷贝数变异(CNV)是癌症中最重要的体细胞畸变之一，因为致癌基因的激活往往归因于染色体拷贝数扩增，而抑癌基因的失活往往是由突变相关的杂合缺失或纯合缺失引起的，其中包括特定DNA片段的增殖和缺失。现在大量研究已经发现了CNVs和癌症之间的联系5。因此，体细胞CNV的鉴定对肿瘤预后和改善治疗有重要作用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是，提供细胞核CNV的检测试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。
[0005]本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：
[0006]本专利技术提供了细胞核CNV的检测试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒通过检测细胞核CNV的异常来判定是否为肿瘤。
[0007]作为优选实施方案，所述肿瘤为泌尿系统肿瘤。
[0008]作为优选实施方案，所述泌尿系统肿瘤包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、尿路上皮癌、睾丸癌。
[0009]作为优选实施方案，所述细胞核CNV的检测试剂包括：细胞核DNA提取试剂，细胞核DNA建库测序试剂、细胞核CNV分析系统。
[0010]作为优选实施方案，所述细胞核CNV的检测试剂还包括细胞膜裂解试剂和细胞核富集装置。
[0011]所述的细胞膜裂解试剂可以是市售的试剂盒，也可以是包含triton X
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100，CHAPS，NP
‑
40，n
‑
dodecyl
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β
‑
D
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maltoside，Tween
‑
20以及Digitonin的任意一种或一种以上任意组合的细胞膜裂解试剂。
[0012]细胞膜裂解后的溶液，高速离心，收集细胞核。可以采用任意形式的细胞核富集装置实现对细胞核的收集。
[0013]作为优选实施方案，所述细胞核DNA提取试剂选自碱裂解法提取试剂、酚抽提法提
取试剂、硅胶膜离心柱提取试剂、磁珠法提取试剂；另外也可选用市售的DNA提取试剂。
[0014]作为优选实施方案，所述细胞核DNA建库测序试剂采用市售的微量建库试剂盒进行DNA建库；可以是Illumina公司的Nextera XT DNA Library Preparation Kit(货号：FC
‑
131
‑
1024)、NEB公司的Ultra
TM
II FS DNA Library Prep Kit for Illumina(货号：E6177)，也可以是Kapa公司的KAPA HyperPlus Kit(货号：7962401001)。然后对构建的细胞核DNA文库进行测序，双端150，每个样本数据需求量3G。
[0015]作为优选实施方案，所述细胞核CNV分析系统包括如下分析步骤：
[0016]1)使用fastp软件对原始测序数据(fastq格式序列)对低质量序列和接头序列的截短去除，评估测序质量，关键参数：
‑
q 25；
[0017]2)使用bwa软件将过滤过后的测序数据比对到参考基因组(hg19)，使用SAMtools对BAM比对文件按照比对位置进行排序，进一步对BAM文件进行重复序列的去除，减少光学重复和PCR重复序列的干扰；
[0018]3)使用R包QDNAseq对步骤2中获得的BAM文件进行固定bin区间内的log2 ratio的计算鉴定，bin区间的大小分别选取500kb和1Mb。获得bin区间的log2 ratio后进一步进行segmentation，segmentation方法使用log2
‑
transformation，对CNV进行鉴定。
[0019]本专利技术还提供一种肿瘤诊断试剂盒，包括：细胞核DNA提取试剂，细胞核DNA建库测序试剂、细胞核CNV分析系统。
[0020]作为优选实施方案，所述肿瘤诊断试剂盒还包括细胞膜裂解试剂和细胞核富集装置。
[0021]作为一个优选实施方式，本专利技术对肿瘤细胞细胞核检测CNV的具体步骤为：
[0022]细胞收集及细胞膜裂解：
[0023]1)准备尿液样本适量，低速离心，去上清，得细胞沉淀；
[0024]2)所得细胞沉淀重悬到0.1％的NP
‑
40溶液中，震荡孵育15分钟；
[0025]3)将孵育后的样本，1000g离心10分钟，去除上清，得到的细胞核沉淀使用500uL PBS缓冲液重悬。
[0026]肿瘤细胞细胞核富集：
[0027]将上述细胞核重悬液，使用孔径为8um，厚度为5um，孔径间隙为10um的滤膜进行过滤，膜上截留的部分即为富集到的肿瘤细胞核。
[0028]肿瘤细胞细胞核DNA的提取以及文库构建：
[0029]将富集到肿瘤细胞核使用QIAGEN公司的微量DNA提取试剂盒QIAamp DNA Micro Kit(50)(货号：56304)进行DNA的提取，详细操作流程见试剂盒说明书。
[0030]DNA文库测序：
[0031]将得到的细胞核DNA使用NEB公司的Ultra
TM
II FS DNA Library Prep Kit for Illumina(货号：E6177)进行文库构建，详细操作流程见试剂盒说明书。将制备好的文库送明码生物进行测序，双端150，每个样本数据需求量3G。
[0032]细胞核CNV分析：
[0033]1)使用fastp软件对原始测序数据(fastq格式序列)对低质量序列和接头序列的截短去除，评估测序质量，关键参数：
‑
q 25。
[0034]2)使用bwa软件将过滤过后的测序数据比对到参考基因组(hg19)，使用SAMtools
对BAM比对文件按照比对位置进行排序，进一步对BAM文件进行重复序列的去除，减少光学重复和PCR重复序列的干扰。
[0035]3)使用R包QDNAseq对步骤2中获得的BAM文件进行固定bin区间内的log2 ratio的计算鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.细胞核CNV的检测试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒通过检测细胞核CNV的异常来判定是否为肿瘤。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为泌尿系统肿瘤。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述泌尿系统肿瘤包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、尿路上皮癌、睾丸癌。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞核CNV的检测试剂包括：细胞核DNA提取试剂，细胞核DNA建库测序试剂、细胞核CNV分析系统。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细胞核CNV的检测试剂还包括细胞膜裂解试剂和细胞核富集装置。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细胞核DNA提取试剂选自碱裂解法提取试剂、酚抽提法提取试剂、硅胶膜离心柱提取试剂、磁珠法提取试剂。7.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细胞核DNA建库测序试剂采用市售的微量建库试剂盒进行DNA建库；并对文库进行测序，双端150，每个样本数据需求量3G。8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞核CNV分析系统包括如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱祺，王晓楠，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：