一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，包括如下步骤：S1、构建测序文库，并创建肿瘤样本；S2、ctDNA突变程度分析，根据肿瘤样本以及测序文库进行捕获测序得到FASTQ文件，肿瘤样本中的cfDNA携带有预先接入的分子标签；S3、根据测序文库进行若干轮巢式PCR扩增，通过第一轮PCR扩增对产物进行测序；S4、以第一轮PCR的产物为模板，采用引物组合乙进行第二轮PCR扩增，并进行测序，根据第一轮PCR扩增结合第二轮PCR扩增测序结果分析DNA样本中目标甲基化发生情况。本方法制备的测序文库能支持后续检测，每次检测的结果都可以代表全部原始ctDNA标本的突变状况及酶切位点覆盖区域的甲基化修饰情况，且不会造成灵敏度和特异性的降低。度和特异性的降低。度和特异性的降低。

【技术实现步骤摘要】
一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法


[0001]本专利技术涉及癌症的筛查
，具体涉及一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法。

技术介绍

[0002]循环肿瘤DNA(ctDNA)来源于肿瘤细胞的凋亡、坏死或分泌产生的DNA片段，含有与肿瘤组织DNA相同的基因变异和表观修饰，如点突变、基因重排、融合、拷贝数变异、甲基化修饰等。ctDNA的检测可以应用于癌症早期筛查、诊断和分期、指导靶向用药、疗效评估、复发监测等各方面。结合ctDNA携带的肿瘤特异基因的变异和甲基化两方面信息，有助于提高检测的灵敏度和特异性，更早发现癌症踪迹，对于肿瘤早筛有重要意义。
[0003]目前，用于早筛的ctDNA突变分析，一般利用肿瘤特征性的热点突变的组合作为标志物。但是突变标志物的位点在各个癌种中有所区别，即便在热点突变比较集中的肝癌中，也至少需要十几个基因上百个位点的检测来覆盖该癌种的大多数患者，达到筛查的目的。
[0004]对于位点的检测，若使用常用的PCR(指聚合酶链式反应)方法，会需要上百毫升的血液样本，对于普本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、构建测序文库，并创建肿瘤样本；S2、ctDNA突变程度分析，根据肿瘤样本以及测序文库进行捕获测序得到FASTQ文件，所述肿瘤样本中的cfDNA携带有预先接入的分子标签；S3、根据测序文库进行若干轮巢式PCR扩增，通过第一轮PCR扩增对产物进行测序；S4、以第一轮PCR的产物为模板，采用引物组合乙进行第二轮PCR扩增，并进行测序，根据第一轮PCR扩增结合第二轮PCR扩增测序结果分析DNA样本中目标甲基化发生情况。2.根据权利要求1所述的一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，其特征在于：步骤S1所述的构建测序文库，具体为：1)筛选差异性ctDNA甲基化位点；2)ctDNA甲基化探针的筛选；3)NKTCL的ctDNA甲基化诊断模型的构建与验证；4)NKTCL的ctDNA甲基化预后模型的构建与验证。3.根据权利要求2所述的一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，其特征在于：所述筛选差异性ctDNA甲基化位点的流程为：收集250
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350例NKTCL患者和250
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350例正常人的血浆标本；使用cfDNA提取试剂盒提取游离DNA，通过高通量全基因组甲基化测序进行全基因组ctDNA甲基化水平检测，建立约300万位点的甲基化文库；通过甲基化水平差异分析，筛选得到p＜0.05、甲基化水平差异倍数前2000的甲基化位点用于后续队列研究；根据该2000个差异甲基化位点设计相应的甲基化探针，通过PCR验证筛选可产生阳性且特异性的PCR扩增信号的甲基化位点。4.根据权利要求3所述的一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，其特征在于：所述使用cfDNA提取试剂盒提取游离DNA的步骤包括：取200μl血液至1.5ml离心管中，加入400μl细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清，向细胞核沉淀中加入200μl缓冲液GS，震荡至彻底混匀；加入200μl缓冲液GB和20μl Proteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀，55℃放置12min，至溶液变清亮；室温放置5
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10min后加入300μl缓冲液BD，充分颠倒混匀。5.根据权利要求1所述的一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，其特征在于：步骤S2所述的ctDNA突变程度分析，具体为：分别提取所述FAS...

【专利技术属性】
技术研发人员：王思振，
申请(专利权)人：无锡泛生子生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：