一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，包括如下步骤：S1、构建测序文库，并创建肿瘤样本；S2、ctDNA突变程度分析，根据肿瘤样本以及测序文库进行捕获测序得到FASTQ文件，肿瘤样本中的cfDNA携带有预先接入的分子标签；S3、根据测序文库进行若干轮巢式PCR扩增，通过第一轮PCR扩增对产物进行测序；S4、以第一轮PCR的产物为模板，采用引物组合乙进行第二轮PCR扩增，并进行测序，根据第一轮PCR扩增结合第二轮PCR扩增测序结果分析DNA样本中目标甲基化发生情况。本方法制备的测序文库能支持后续检测，每次检测的结果都可以代表全部原始ctDNA标本的突变状况及酶切位点覆盖区域的甲基化修饰情况，且不会造成灵敏度和特异性的降低。度和特异性的降低。度和特异性的降低。

【技术实现步骤摘要】
一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法


[0001]本专利技术涉及癌症的筛查
，具体涉及一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法。

技术介绍

[0002]循环肿瘤DNA(ctDNA)来源于肿瘤细胞的凋亡、坏死或分泌产生的DNA片段，含有与肿瘤组织DNA相同的基因变异和表观修饰，如点突变、基因重排、融合、拷贝数变异、甲基化修饰等。ctDNA的检测可以应用于癌症早期筛查、诊断和分期、指导靶向用药、疗效评估、复发监测等各方面。结合ctDNA携带的肿瘤特异基因的变异和甲基化两方面信息，有助于提高检测的灵敏度和特异性，更早发现癌症踪迹，对于肿瘤早筛有重要意义。
[0003]目前，用于早筛的ctDNA突变分析，一般利用肿瘤特征性的热点突变的组合作为标志物。但是突变标志物的位点在各个癌种中有所区别，即便在热点突变比较集中的肝癌中，也至少需要十几个基因上百个位点的检测来覆盖该癌种的大多数患者，达到筛查的目的。
[0004]对于位点的检测，若使用常用的PCR(指聚合酶链式反应)方法，会需要上百毫升的血液样本，对于普通的早筛体检可行性较低；且PCR方法检测突变会有较高的技术来源与克隆性造血来源的假阳性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的对于普通的早筛体检可行性较低；且PCR方法检测突变会有较高的技术来源与克隆性造血来源的假阳性问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，包括如下步骤：
[0008]S1、构建测序文库，并创建肿瘤样本；
[0009]S2、ctDNA突变程度分析，根据肿瘤样本以及测序文库进行捕获测序得到FASTQ文件，所述肿瘤样本中的cfDNA携带有预先接入的分子标签；
[0010]S3、根据测序文库进行若干轮巢式PCR扩增，通过第一轮PCR扩增对产物进行测序；
[0011]S4、以第一轮PCR的产物为模板，采用引物组合乙进行第二轮PCR扩增，并进行测序，根据第一轮PCR扩增结合第二轮PCR扩增测序结果分析DNA样本中目标甲基化发生情况。
[0012]优选的，步骤S1所述的构建测序文库，具体为：
[0013]1)筛选差异性ctDNA甲基化位点；
[0014]2)ctDNA甲基化探针的筛选；
[0015]3)NKTCL的ctDNA甲基化诊断模型的构建与验证；
[0016]4)NKTCL的ctDNA甲基化预后模型的构建与验证。
[0017]优选的，所述筛选差异性ctDNA甲基化位点的流程为：
[0018]收集400例NKTCL患者和400例正常人的血浆标本；
[0019]使用cfDNA提取试剂盒提取游离DNA，通过高通量全基因组甲基化测序进行全基因组ctDNA甲基化水平检测，建立约300万位点的甲基化文库；
[0020]通过甲基化水平差异分析，筛选得到p＜0.05、甲基化水平差异倍数前2000的甲基化位点用于后续队列研究；
[0021]根据该2000个差异甲基化位点设计相应的甲基化探针，通过PCR验证筛选可产生阳性且特异性的PCR扩增信号的甲基化位点。
[0022]优选的，所述使用cfDNA提取试剂盒提取游离DNA的步骤包括：
[0023]取200μl血液至1.5ml离心管中，加入400μl细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清，向细胞核沉淀中加入200μl缓冲液GS，震荡至彻底混匀；
[0024]加入200μl缓冲液GB和20μl Proteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀，55℃放置12min，至溶液变清亮；
[0025]室温放置5
‑
10min后加入300μl缓冲液BD，充分颠倒混匀。
[0026]优选的，步骤S2所述的ctDNA突变程度分析，具体为：
[0027]分别提取所述FASTQ文件中配对reads中的分子标签并存储为uBAM文件；
[0028]将所述FASTQ文件的基因序列与参考基因组进行比对并去重得到BAM文件，并将其与所述uBAM文件合并得到含有分子标签的BAM文件；
[0029]根据分子标签对BAM文件中的reads进行聚集并去重；
[0030]在所述基因突变panel区域使用pileup方法得到样本原始突变集合；
[0031]对肿瘤样本原始突变集合中的基因突变参数进行统计，所述基因突变参数包括：基因突变等级、各等级基因突变数量及突变频率；
[0032]根据预先构建的过滤规则对肿瘤样本原始突变集合进行过滤，并对各样本的基因突变参数进行统计；
[0033]针对肿瘤样本的基因突变参数使用预先构建的突变分析模型对所述待检测血浆样本的突变程度进行评估。
[0034]优选的，所述基因突变等级包括等级D、等级C、等级B及等级A，其中，等级D中包括预设癌症数据库中的致癌基因，等级C中包括预设癌症数据库中等级D之外的抑癌基因或功能性判断为有害的其他抑癌基因，等级B中包括等级D和等级C之外的外显子区域基因，等级A中包括等级D、等级C和等级B之外的基因；
[0035]所述基因突变参数包括：等级D的突变数量、等级D的突变最大突变频率值、等级C的突变数量、等级C的突变最大突变频率值、等级B的突变数量、等级B的突变最大突变频率值、等级A的突变数量及等级A的突变最大突变频率值。
[0036]优选的，所述根据预先构建的过滤规则对肿瘤样本原始突变集合进行过滤中对所述样本原始突变集合进行过滤的流程包括：
[0037]在外周血白细胞中超过给定频率的胚系突变；
[0038]在特异于指定panel大量历史样本的数据库中重复出现的黑名单位点，以及数据库中人群频率超过设定阈值的位点；
[0039]由大于给定数量的健康人血浆样本的cfDNA在相同测序条件下构建背景噪音基线。
[0040]优选的，所述ctDNA甲基化探针的筛选的步骤为：
[0041]收集若干例治疗前NKTCL肿瘤组织标本和相应的血浆标本，使用组织DNA和血浆ctDNA试剂盒提取肿瘤组织DNA和血浆ctDNA；
[0042]以候选甲基化位点为差异位点，使用靶向重亚硫酸盐测序检测肿瘤组织DNA与相应匹配的血浆ctDNA的候选甲基化位点的甲基化水平；
[0043]比对组织标本DNA与血浆ctDNA甲基化水平的一致性，选择一致性较好、检测丰度较高的候选甲基化位点用于后续建模。
[0044]综上所述，由于采用了上述技术，本专利技术的有益效果是：
[0045]本专利技术中，样本量需求低，而且该方法制备的测序文库能支持后续检测，每次检测的结果都可以代表全部原始ctDNA标本的突变状况及酶切位点覆盖区域的甲基化修饰情况，且不会造成灵敏度和特异性的降本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、构建测序文库，并创建肿瘤样本；S2、ctDNA突变程度分析，根据肿瘤样本以及测序文库进行捕获测序得到FASTQ文件，所述肿瘤样本中的cfDNA携带有预先接入的分子标签；S3、根据测序文库进行若干轮巢式PCR扩增，通过第一轮PCR扩增对产物进行测序；S4、以第一轮PCR的产物为模板，采用引物组合乙进行第二轮PCR扩增，并进行测序，根据第一轮PCR扩增结合第二轮PCR扩增测序结果分析DNA样本中目标甲基化发生情况。2.根据权利要求1所述的一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，其特征在于：步骤S1所述的构建测序文库，具体为：1)筛选差异性ctDNA甲基化位点；2)ctDNA甲基化探针的筛选；3)NKTCL的ctDNA甲基化诊断模型的构建与验证；4)NKTCL的ctDNA甲基化预后模型的构建与验证。3.根据权利要求2所述的一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，其特征在于：所述筛选差异性ctDNA甲基化位点的流程为：收集250
‑
350例NKTCL患者和250
‑
350例正常人的血浆标本；使用cfDNA提取试剂盒提取游离DNA，通过高通量全基因组甲基化测序进行全基因组ctDNA甲基化水平检测，建立约300万位点的甲基化文库；通过甲基化水平差异分析，筛选得到p＜0.05、甲基化水平差异倍数前2000的甲基化位点用于后续队列研究；根据该2000个差异甲基化位点设计相应的甲基化探针，通过PCR验证筛选可产生阳性且特异性的PCR扩增信号的甲基化位点。4.根据权利要求3所述的一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，其特征在于：所述使用cfDNA提取试剂盒提取游离DNA的步骤包括：取200μl血液至1.5ml离心管中，加入400μl细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清，向细胞核沉淀中加入200μl缓冲液GS，震荡至彻底混匀；加入200μl缓冲液GB和20μl Proteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀，55℃放置12min，至溶液变清亮；室温放置5
‑
10min后加入300μl缓冲液BD，充分颠倒混匀。5.根据权利要求1所述的一种检测ctDNA中肿瘤特异基因的突变和甲基化的方法，其特征在于：步骤S2所述的ctDNA突变程度分析，具体为：分别提取所述FAS...

【专利技术属性】
技术研发人员：王思振，
申请(专利权)人：无锡泛生子生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：