检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂、试剂盒及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术通过利用微小隐孢子虫全虫蛋白作为抗原，采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体；用荧光染料标记步骤S1所得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体，即获得检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂。应用本发明专利技术试剂建立的直接免疫荧光检测方法，可用于临床粪便样本及环境中微小隐孢子虫的检测及鉴定，且敏感性高、特异性强、稳定性好、诊断速度快，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]隐孢子虫为胞内寄生性原虫，进入宿主体内后主要寄生于胃肠道上皮细胞的刷状边缘。隐孢子虫病在世界范围内分布广泛，是造成多种动物和人腹泻的主要原因。在免疫功能正常的感染动物中，腹泻是短期的，一般持续约2
‑
3周。在免疫缺陷者，如艾滋病患者中，伴随着长期及持续性腹泻，严重可危及生命。隐孢子虫主要通过粪
‑
口传播，人和动物主要通过误食了被污染的食物和水感染。在低收入和中等收入国家，隐孢子虫病是导致中度至重度腹泻甚至死亡的重要原因之一。在高收入国家，隐孢子虫病是食源性及水源性暴发的主要原因，是多个国家饮用水必检病原之一。隐孢子虫作为人兽共患寄生性原虫，严重威胁着人类的生命健康，给畜牧业发展带来了巨大的经济损失。因此，对隐孢子虫的快速检测有利于对该病做到早发现早预防，降低发病率，对人类健康及畜牧业发展都至关重要。
[0003]目前常用的隐孢子虫检测方法主要有病原学检测、免疫学检测以及分子学检测等，其中病原学检测的敏感性有限，且依赖专业技术人员。分子学检测具有较好的敏感性，可区分出虫种及亚型，但也存在耗时，技术要求高等缺点。免疫学检测较其它几种方法具有较高的灵敏度，已被广泛应用于隐孢子虫的检测。其中基于单克隆抗体的免疫荧光检测是一种较好的检测方法，能对卵囊数量较少的样本进行检测。目前，国外已有基于免疫学方法的商业试剂盒问世，例如美国waterborne公司的试剂盒，能够通过直接免疫荧光检测隐孢子虫卵囊，其生产的抗体针对隐孢子虫卵囊壁抗原，用于检测粪便、食物及环境样品中的隐孢子虫。目前国际上检测水中隐孢子虫的金标准是EPA 1623法，此方法也涉及了该试剂盒中的抗体。该抗体价格昂贵，效价较低(1：20)，无法普及利用。因此，研发出效价更高的检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂及其试剂盒，能极大缩小检测成本，对人类健康、临床、科研机构及养殖业隐孢子虫病的检测、诊断和防控均具有重要意义。

技术实现思路

[0004]为解决相关问题，本专利技术的首要目的在于提供检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂盒。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
[0008]S1、利用微小隐孢子虫全虫蛋白作为抗原，采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体；
[0009]S2、用荧光染料标记步骤S1所得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体，即获得检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂。
[0010]优选的，所述的步骤S1中，微小隐孢子虫全虫蛋白通过如下方法获得：取微小隐孢子虫卵囊，4℃条件下，13200r/min离心3min，次氯酸钠溶液冰上处理10min，离心并去除次氯酸钠溶液，加入蛋白酶抑制剂和PBS后进行冰上超声破碎处理，而后于液氮中反复冻融后得到微小隐孢子虫全虫蛋白溶液。
[0011]更优选的，所述的次氯酸钠溶液的浓度为1.3wt％。
[0012]更优选的，所述的蛋白酶抑制剂和PBS的体积比为1：200。
[0013]优选的，所述的步骤S1中，抗微小隐孢子虫的单克隆抗体的亚类为IgG1，仅与微小隐孢子虫的卵囊壁反应。
[0014]优选的，所述的步骤S1中，采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体的具体步骤为：
[0015](1)取微小隐孢子虫全虫蛋白与等体积佐剂混合，乳化后对小鼠进行背部皮下多点注射免疫，首免后第14、28、35天分别进行二至四免；四免后第7天断尾采血分离血清，通过间接ELISA方法检测血清的抗体效价，在血清抗体效价达到十万后，用不加佐剂的全虫蛋白溶液腹腔冲击免疫小鼠，3天后进行融合；
[0016](2)细胞融合：将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5：1的比例置于融合瓶中，离心后弃上清，重悬细胞沉淀后沿管壁加入预热的50％PEG融合剂，缓慢加入无血清DMEM培养基终止融合，静置后离心；使用HAT培养基悬浮细胞沉淀，混合后加入含有饲养细胞的细胞培养板，置于恒温CO2培养箱中培养；
[0017](3)杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆：使用间接ELISA法及间接免疫荧光法同时筛选目的阳性融合细胞，并进行两轮亚克隆，获得能稳定分泌针对微小隐孢子虫卵囊壁的杂交瘤细胞株；其中使用间接ELISA法检测时采用微小隐孢子虫全虫蛋白作为检测抗原，使用间接免疫荧光法检测时采用微小隐孢子虫作为检测抗原；
[0018](4)单克隆抗体制备：选择经产雌性BALB/c小鼠腹腔注射降植烷，7天后腹腔内注射杂交瘤细胞，待小鼠腹腔明显隆起时收集小鼠腹水，采集的小鼠腹水经离心后取上清液保存，经纯化后即获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体。
[0019]更优选的，所述的步骤(1)中，首免使用弗氏完全佐剂，二至四免使用弗氏不完全佐剂。
[0020]更优选的，所述的步骤(2)中，离心的条件均为：转速1000r/min，时间5min。
[0021]更优选的，所述的步骤(2)中，预热的温度为42℃。
[0022]更优选的，所述的步骤(4)中，降植烷的注射量为0.5mL/只。
[0023]更优选的，所述的步骤(4)中，杂交瘤细胞的注射量1
×
106个/只。
[0024]更优选的，所述的步骤(4)中，离心的条件均为：转速10000r/min，时间10min。
[0025]更优选的，所述的步骤(4)中，保存的温度为
‑
20℃。
[0026]优选的，所述的步骤S1中，用荧光染料标记步骤S1所得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体的具体步骤为：在稀释的单克隆抗体溶液中加入硼酸缓冲液，而后加入到荧光染料试剂中，室温下避光孵育后取出至装有纯化树脂的离心柱中，轻微震荡，使荧光染料标记的抗体与树脂完全混匀，离心后得到荧光标记的抗体。
[0027]更优选的，所述的稀释的单克隆抗体溶液的浓度为2mg/mL。
[0028]更优选的，所述的稀释的单克隆抗体溶液、硼酸缓冲液、荧光染料的配比为0.5mL：
40μL：50μg。
[0029]一种检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂，通过上述制备方法得到。
[0030]一种检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂盒，其免疫荧光试剂为上述检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂。
[0031]上述检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂或试剂盒在检测环境中的隐孢子虫的应用。
[0032]所述的环境包括但不限于水体、土壤、粪便。
[0033]所述的应用包括如下步骤：使用上述直接免疫荧光检测试剂或试剂盒对待测样本进行检测；置荧光显微镜下观察，以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、利用微小隐孢子虫全虫蛋白作为抗原，采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体；S2、用荧光染料标记步骤S1所得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体，即获得检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂。2.根据权利要求1所述的检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤S1中，微小隐孢子虫全虫蛋白通过如下方法获得：取微小隐孢子虫卵囊，4℃条件下，13200r/min离心3min，次氯酸钠溶液冰上处理10min，离心并去除次氯酸钠溶液，加入蛋白酶抑制剂和PBS后进行冰上超声破碎处理，而后于液氮中反复冻融后得到微小隐孢子虫全虫蛋白溶液；所述的次氯酸钠溶液的浓度为1.3wt％；所述的蛋白酶抑制剂和PBS的体积比为1：200。3.根据权利要求1所述的检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤S1中，抗微小隐孢子虫的单克隆抗体的亚类为IgG1，仅与微小隐孢子虫的卵囊壁反应；采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体的具体步骤为：(1)取微小隐孢子虫全虫蛋白与等体积佐剂混合，乳化后对小鼠进行背部皮下多点注射免疫，首免后第14、28、35天分别进行二至四免；四免后第7天断尾采血分离血清，通过间接ELISA方法检测血清的抗体效价，在血清抗体效价达到十万后，用不加佐剂的全虫蛋白溶液腹腔冲击免疫小鼠，3天后进行融合；(2)细胞融合：将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5：1的比例置于融合瓶中，离心后弃上清，重悬细胞沉淀后沿管壁加入预热的50％PEG融合剂，缓慢加入无血清DMEM培养基终止融合，静置后离心；使用HAT培养基悬浮细胞沉淀，混合后加入含有饲养细胞的细胞培养板，置于恒温CO2培养箱中培养；(3)杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆：使用间接ELISA法及间接免疫荧光法同时筛选目的阳性融合细胞，并进行两轮亚克隆，获得能稳定分泌针对微小隐孢子虫卵囊壁的杂交瘤细胞株；其中使用间接ELISA法检测时采用微小隐孢子虫全虫蛋白作为检测抗原，使用间接免疫荧光法检测时采用微小隐孢子虫作为检测抗原；(4)单克隆抗体制备：选择经产雌性BALB/c小鼠腹腔注射降植烷，7天后腹腔内注射杂交瘤...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖立华，孙连静，冯耀宇，李娜，郭亚琼，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：