一种单链抗体或其衍生物的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种单链抗体或其衍生物的测定方法。本发明专利技术提供了一种单链抗体或其衍生物的测定方法；所述的测定方法为色谱法；所述的色谱法的固定相由基质和与基质连接的配基组成，所述的基质为表面经乙二醇二缩水甘油醚修饰的多孔聚丙烯酸甲酯小球；所述的配基为重组Protein A；所述的单链抗体或其衍生物为单体和/或聚合体；所述的色谱法的流动相依次为流动相A、流动相B、流动相A。该方法能够分离并定量检测单链抗体或其衍生物。定量检测单链抗体或其衍生物。

【技术实现步骤摘要】
一种单链抗体或其衍生物的测定方法


[0001]本专利技术涉及一种单链抗体或其衍生物的测定方法。

技术介绍

[0002]单克隆抗体的典型结构通常包括F
ab
(Fragment of antigen binding)区域和F
c
(fragment crystallizable)区域，其中基因工程蛋白(Protein A或Protein G蛋白)主要与F
c
区域特异性结合，基于此原理可进行抗体的浓度测定或纯化。对于单链抗体(scFv抗体)或其衍生物，由于其结构中缺乏能与Protein A或Protein G蛋白结合的F
c
区域，无法被亲和捕获和定量分析，因此市场上还没有一种用于scFv抗体或其衍生物细胞收获液蛋白浓度定量检测的色谱分析柱，对该类抗体蛋白或基于此结构的多特异性抗体蛋白浓度的准确定量仍为一个难题。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题是现有技术缺乏单链抗体或其衍生物的测定方法，为此，本专利技术提供了一种单链抗体或其衍生物的测定方法，该方法能够分离并定量检测单链抗体或其衍生物。
[0004]本专利技术提供了一种单链抗体或其衍生物的测定方法；所述的测定方法为色谱法；
[0005]所述的色谱法的固定相由基质和与基质连接的配基组成，所述的基质为表面经乙二醇二缩水甘油醚修饰的多孔聚丙烯酸甲酯小球；所述的配基为重组Protein A；
[0006]所述的单链抗体或其衍生物为单体和/或聚合体；r/>[0007]所述的色谱法的流动相依次为流动相A、流动相B、流动相A；所述的流动相A为pH7.0
‑
7.5的缓冲溶液；当所述的单链抗体或其衍生物为单体和/或聚合体时，所述的流动相B为0.08M～0.12M NaOH水溶液，或者，当所述的单链抗体或其衍生物中聚合体的占比小于等于2％时，所述的流动相B为pH＝3.0的100mM Gly
‑
HCl。
[0008]在某一方案中，所述的测定方法中的某些技术特征如下所述，其余的技术特征如其余任一方案所述(以下简称“在某一方案中”)：
[0009]所述的单链抗体可为靶向VEGF
‑
A的单链抗体。
[0010]在某一方案中，所述的单链抗体的V
H
可包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0011]在某一方案中，所述的单链抗体的V
L
可包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
[0012]在某一方案中，所述的单链抗体中的V
H
和V
L
可通过接头1可操作地连接。
[0013]在某一方案中，所述的接头1可包含序列(GGGGS)n，n＝1、2、3或4。
[0014]在某一方案中，所述的单链抗体可含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0015]在某一方案中，所述的单链抗体的衍生物可为包含所述单链抗体的融合蛋白。
[0016]在某一方案中，所述的包含所述单链抗体的融合蛋白可还含有靶向Ang2的VHH。
[0017]在某一方案中，所述的靶向Ang2的VHH可含有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
[0018]在某一方案中，所述的靶向Ang2的VHH可位于所述抗体的C端。
[0019]在某一方案中，所述的单链抗体和所述的靶向Ang2的VHH可通过接头2可操作地连接。
[0020]在某一方案中，所述的接头2可包含序列(GGGGS)n，其中n＝1、2、3或4。
[0021]在某一方案中，所述的包含所述单链抗体的融合蛋白可具有如下结构：单链抗体
‑
接头2
‑
靶向Ang2的VHH。
[0022]在某一方案中，所述的包含所述单链抗体的融合蛋白可含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0023]在某一方案中，所述的单链抗体可为单体和聚合体、或者、聚合体。
[0024]在某一方案中，所述的单链抗体可为单体和聚合体，其中聚合体占比可在35％以上。
[0025]在某一方案中，所述的单链抗体可为单体和聚合体，其中聚合体占比可在90％以上。
[0026]在某一方案中，所述的单链抗体可为单体和聚合体，其中聚合体占比可在95％以上。
[0027]在某一方案中，所述的单链抗体的衍生物可为单体和聚合体、或者、聚合体。
[0028]在某一方案中，所述的单链抗体的衍生物可为单体和聚合体，其中聚合体占比可在35％以上。
[0029]在某一方案中，所述的单链抗体的衍生物可为单体和聚合体，其中聚合体占比可在90％以上。
[0030]在某一方案中，所述的单链抗体的衍生物可为单体和聚合体，其中聚合体占比可在95％以上。
[0031]在某一方案中，所述的聚合体可为二聚体或多聚体(例如三聚体)。
[0032]在某一方案中，所述的测定方法可为定量测定方法。
[0033]在某一方案中，所述的测定方法可为高效液相色谱法。
[0034]在某一方案中，所述的色谱法的固定相的平均粒径可小于等于50μm。
[0035]在某一方案中，所述的色谱法的固定相的平均粒径可为20μm～50μm。
[0036]在某一方案中，所述的基质可为亲水基质。
[0037]在某一方案中，所述的重组Protein A可由通过重组连接的4个经改造的Protein A功能域蛋白组成。
[0038]在某一方案中，所述的重组Protein A可通过取向控制与所述的基质连接。
[0039]在某一方案中，所述的色谱法的固定相可为Amsphere
TM A3 Protein A树脂。
[0040]在某一方案中，所述的固定相的形态为本领域常规的形态，例如色谱柱。
[0041]在某一方案中，所述的色谱柱的尺寸为本领域常规的尺寸，例如4.6
×
50mm。
[0042]在某一方案中，当所述的单链抗体或其衍生物为单体和/或聚合体时，所述的流动相B可为0.1M NaOH水溶液。
[0043]在某一方案中，所述的流动相的流速为本领域常规的流速，例如2ml/min。
[0044]在某一方案中，所述的流动相的洗脱时间为本领域常规的洗脱时间，例如5min。
[0045]在某一方案中，所述的色谱法的洗脱程序可如下所示：
[0046]时间(min)流动相A(％)流动相B(％)
0.0010001.0010001.0101002.0001002.0110005.001000
[0047]在某一方案中，所述的色谱法的柱温为本领域常规的柱温，例如25℃。
[0048]在某一方案中，所述的色谱法的检测波长为本领域常规的检测波长，例如280nm。
[0049]在某一方案中，所述的色谱法的分析对象为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单链抗体或其衍生物的测定方法；所述的测定方法为色谱法；所述的色谱法的固定相由基质和与基质连接的配基组成，所述的基质为表面经乙二醇二缩水甘油醚修饰的多孔聚丙烯酸甲酯小球；所述的配基为重组Protein A；所述的单链抗体或其衍生物为单体和/或聚合体；所述的色谱法的流动相依次为流动相A、流动相B、流动相A；所述的流动相A为pH 7.0
‑
7.5的缓冲溶液；当所述的单链抗体或其衍生物为单体和/或聚合体时，所述的流动相B为0.08M～0.12M NaOH水溶液，或者，当所述的单链抗体或其衍生物中聚合体的占比小于等于2％时，所述的流动相B为pH＝3.0的100mM Gly
‑
HCl。2.如权利要求1所述的单链抗体或其衍生物的测定方法，其特征在于，其满足下述条件中的一个或多个：(1)所述的pH 7.0
‑
7.5的缓冲溶液为pH 7.2的缓冲溶液；(2)所述的pH 7.0
‑
7.5的缓冲溶液为含有磷酸盐、Tris
‑
HCl或醋酸
‑
醋酸钠缓冲溶液；(3)所述的pH 7.0
‑
7.5的缓冲溶液含有或不含有NaCl。3.如权利要求2所述的单链抗体或其衍生物的测定方法，其特征在于，所述的pH 7.0
‑
7.5的缓冲溶液为20mmol/L Tris
‑
HCl，150mmol/L NaCl，pH7.2。4.如权利要求1所述的单链抗体或其衍生物的测定方法，其特征在于，其满足下述条件中的一个或多个：(1)所述的单链抗体为靶向VEGF
‑
A的单链抗体；(2)所述的单链抗体的衍生物为包含所述单链抗体的融合蛋白；(3)所述的单链抗体为单体和聚合体、或者、聚合体；(4)所述的单链抗体的衍生物为单体和聚合体、或者、聚合体；(5)所述的测定方法为定量测定方法；(6)所述的测定方法为高效液相色谱法；(7)所述的色谱法的固定相的平均粒径小于等于50μm；(8)所述的基质为亲水基质；(9)所述的重组Protein A由通过重组连接的4个经改造的Protein A功能域蛋白组成；(10)所述的重组Protein A通过取向控制与所述的基质连接；(11)所述的固定相的形态为色谱柱；(12)当所述的单链抗体或其衍生物为单体和/或聚合体时，所述的流动相B为0.1M NaOH水溶液；(13)所述的流动相的流速为2ml/min；(14)所述的流动相的洗脱时间为5min；(15)所述的色谱法的柱温为25℃；(16)所述的色谱法的检测波长为280nm；(17)所述的色谱法的分析对象含有或不含有所述的单链抗体；(18)所述的色谱法的进样体积为5μL
‑
25μL；(19)所述的色谱法的进样量为5μg
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25μg。5.如权利要求4所述的单链抗体或其衍生物的测定方法，其特征在于，其还满足下述条件中的一个或多个：
(1)所述的单链抗体的V
H
包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；(2)所述的单链抗体的V
L
包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；(3)所述的单链抗体中的V
H
和V
L
通过接头1可操作地连接；(4)所述的包含所述单链抗体的融合蛋白还含有靶向Ang2的VHH；(5)当所述的单链抗体为单体和聚合体时，其中聚合体占比在35％以上；(6)当所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢红伟，王晟楠，高亚婷，
申请(专利权)人：信达生物制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：