一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19及其应用。本发明专利技术以紫心甘薯品系“A5”为实验材料，克隆了IbbHLH2、IbMYB1或IbWD40的启动子序列，通过酵母单杂交文库筛选实验，获得了对IbbHLH2、IbMYB1和IbWD40基因均具有调控作用的上游调控因子IbPGP19。运用酵母单杂交回转实验和双荧光素酶报告系统检测证实，IbbHLH2、IbMYB1或IbWD40启动子与上游调控因子IbPGP19之间存在相互作用。本发明专利技术在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。

【技术实现步骤摘要】
SCIENCE and TECHNOLOGY,2021,40(1).)。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题在于筛选一种促进紫心甘薯IbbHLH2、IbMYB1和/或IbWD40转录因子表达的上游调控因子。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术首先用Trizol法从甘薯块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA，构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库。
[0007]进一步的，以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶Max DNA Polymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbbHLH2、IbMYB1或IbWD40的启动子DNA片段，并将启动子IbbHLH2、IbMYB1或IbWD40构建到pAbAi载体中，扩增IbbHLH2的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序列如下所示：
[0008]PIbbHLH2
‑
F：5'
‑
GCATAACTTATAATCTTAAGTATGATGATCATAT
‑
3'和
[0009]PIbbHLH2
‑
R：5'
‑
CTACCTAAGAATTTCTAGTAGAGGTAAATTGTA
‑
3'。
[0010]扩增IbMYB1的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序列如下所示：
[0011]PIbMYB1
‑
F：5'
‑
TTATTACATCAAGCTAAATAAATACGATTTG
‑
3'和
[0012]PIbMYB1
‑
R：5'
‑
TATATATATTGAAGGGTGTCGGAAATTC
‑
3'。
[0013]扩增IbWD40的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序列如下所示：
[0014]PIbWD40
‑
F：5'
‑
TCCTAGCCAAGAAGAGTGGAGAGA
‑
3'和
[0015]PIbWD40
‑
R：5'
‑
TCTCATACCACCACACCCTAGTGG
‑
3'。
[0016]构建的pAbAi
‑
PIbbHLH2诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活AbA最低抑制浓度为700ng/mL。
[0017]构建的pAbAi
‑
PIbMYB1诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活AbA最低抑制浓度为400ng/mL。
[0018]构建的pAbAi
‑
PIbWD40诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活AbA最低抑制浓度为300ng/mL。
[0019]本专利技术其次将诱饵菌株制成Y1HGold感受态细胞，把文库质粒转入pAbAi
‑
PIbbHLH2、pAbAi
‑
PIbMYB1或pAbAi
‑
PIbWD40诱感受态细胞中，通过酵母单杂交筛库对结合蛋白进行筛选，筛选得到了紫心甘薯IbbHLH2、IbMYB1、IbWD40基因表达的上游调控因子为IbPGP19。
[0020]因此，本专利技术的第一个目的是提供一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0021]本专利技术的第二个目的是提供一种上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0022]本专利技术的第三个目的是提供一种含有上述的编码基因的重组载体或重组菌。
[0023]本专利技术的第四个目的是提供一种含有上述的编码基因的表达盒。
[0024]本专利技术的第五个目的是提供一种上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19的扩增引物，该扩增引物的具体序列如下所示：
[0025]IbPGP19
‑
F：5'
‑
ATGGCGAGCACAAGTTATACGA
‑
3'和
[0026]IbPGP19
‑
R：5'
‑
CTAAAATACCGTGACACATGAGCC
‑
3'。
[0027]本专利技术的第六个目的是提供上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19在促进甘薯IbbHLH2、IbMYB1和/或IbWD40转录因子表达中的应用。
[0028]本专利技术的第七个目的是提供上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19在促进甘薯花色素苷生物合成中的应用。
[0029]本专利技术的第八个目的是提供上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19在甘薯高花色素苷品种选育中的应用。
[0030]本专利技术的第九个目的是提供一种促进甘薯花色素苷合成的方法，是在甘薯植株中过表达上述的调控因子IbPGP19。
[0031]进一步的，为了进一步验证筛选出来的调控因子IbPGP19与启动子IbbHLH2、IbMYB1或IbWD40结合，将IbPGP19构建到pGADT7酵母重组表达载体，选择载体中EcoRⅠ和BamHⅠ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2。将pGADT7
‑
IbPGP19酵母重组表达载体质粒与pAbAi
‑
PIbbHLH2、pAbAi
‑
PIbMYB1或pAbAi
‑
PIbWD40诱饵载体共同转化Y1HGold酵母中进行酵母单杂交实验，结果发现：阳性对照p53AbAi+AD
‑
53转化的菌株在SD/
‑
Leu/AbA培养基上能够生长，而阴性对照PIbbHLH2
‑1‑
pAbAi+pGADT7、PIbMYB1
‑4‑
pAbAi+pGADT7或PIbWD40
‑1‑
pAbAi+pGADT7空载转化的菌株不能在SD/
‑
Leu/AbA培养基上生长。说明该酵母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。而PIbbHLH2
‑1‑
pAbAi+IbPGP19
‑
pGADT7、PIbMYB1
‑4‑
pAbAi+IbPGP19
‑
pGADT7或PIbWD40
‑1‑
pAbAi+IbPGP19
‑
pGADT7在SD/
‑
Leu/AbA培养基上能够生长(图1
‑
3)，说明IbPGP19蛋白能结合在启动子IbbHLH2、IbMYB1或IbWD40上。
[0032]进一步的，为了验证启动子IbbHLH2、IbMYB1或IbWD40与其调控因子IbPGP19的相互作用，本专利技术将IbPGP19构建到过表达载体pGreenII 00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19的基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体或重组菌。5.含有权利要求2或3所述的编码基因的表达盒。6.一种权利要求1所述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为IbPGP19
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F：5'
‑
ATGGCGAGCACAAGTTATACGA
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【专利技术属性】
技术研发人员：付丹文，陈亚慧，陈卫卫，黄咏虹，
申请(专利权)人：广东省科学院南繁种业研究所，
类型：发明
国别省市：