一种高灵敏度甘胆酸单链抗体及其筛选方法与应用技术

本发明专利技术公开一种高灵敏度甘胆酸单链抗体及其筛选方法与应用，旨在提供一种具有高灵敏性，可用于甘胆酸的快速免疫检测，具有良好的应用价值的甘胆酸单链抗体；该其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述单链抗体是以甘胆酸免疫原免疫动物，利用异源包被抗原进行筛选所得；涉生物技术领域。涉生物技术领域。涉生物技术领域。

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏度甘胆酸单链抗体及其筛选方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程、抗体工程
和免疫学检测领域，涉及一种以异源包被抗原筛选高灵敏度甘胆酸单链抗体的方法。

技术介绍

[0002]甘胆氨酸(Glycocholicacid,GCA)，属于二级胆酸，是类固醇酸的衍生物，由胆酸和甘氨酸在肝脏中结合生成的结合型胆酸，是胆汁酸的主要成分之一。GCA具有促进脂类乳化，加速脂类物质的消化和吸收的作用。甘胆氨酸在血液和尿液中的浓度高低与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关。因此，建立甘胆氨酸检测方法对其进行有效监测可以为各类肝脏疾病的鉴别、诊断、治疗和预后分析提供重要的依据。
[0003]目前，GCA的检测方法主要包括高效液相色谱法、液质联用法、免疫学分析法等等。免疫分析法基于抗体和抗原之间特异性结合，具有灵敏度高、特异性强、简单、快速和便宜等优点，特别适用于大批量样本的筛查。
[0004]抗体是影响免疫分析方法特异性和灵敏性的重要因素之一。传统的抗体包括多克隆抗体(polyclonalantibodies，pAb)和单克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏度甘胆酸单链抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体，其特征在于，其核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体，其特征在于，所述的氨基酸序列由核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的重链可变区、核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的连接肽和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的轻链可变区组成，所述的连接肽位于重链可变区和轻链可变区之间。4.权利要求1或者2所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)合成免疫抗原首先制备半抗原，将半抗原溶于溶液中，加入二环己基碳二亚胺和NHS，室温下搅拌反应；最后，离心取上清滴入牛血清白蛋白中，室温下搅拌反应，在PBS中透析得到异源包被抗原；2)动物免疫免疫宿主用磷酸盐缓冲液对甘胆酸免疫抗原进行稀释为1mg/mL，与等体积的弗氏佐剂乳化后进行免疫来亨鸡5次；3)抗体库的构建分离免疫后的来亨鸡脾脏的淋巴细胞，提取总RNA并逆转录合成cDNA，扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因，通过overlapPCR组装成scFv，与pCom3X质粒连接，点击转化至EcoliER2738感受态细胞中，构建原始抗体文库，并加入辅助噬菌体VCSM13，得到噬菌体抗体文库；4)特异性单链抗体的淘选利用步骤1)制备的异源包被抗原包被酶标板，加入噬菌体抗体文库，室温下孵育1小时，用PBST洗涤未结合的噬菌体，然后添加甘胆酸洗脱结合的噬菌体，重复上述操作4次，筛选出灵敏度较高的噬菌体；5)特异性单链抗体的表达提取阳性噬菌粒，热击转化至E.coliTOP10F
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表达宿主菌中，加入IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，利用镍亲和层析柱进行纯化，得到高灵敏的抗甘胆酸单链抗体。5.根据权利要求4所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，其特征在于，将2g甘胆酸溶于10mL甲醇中，加入0.3mL浓硫酸，100℃加热回流进行酯化反应，利用乙酸乙酯进行萃取得到甘胆酸甲酯；然后，将0.1g甘胆酸甲酯溶于100mL氯仿中，在0.1mL三乙胺的催化作用，与0.2g琥珀酸酐进行反应，得到半抗原。6.根据权利要求4所述的高灵敏度甘胆酸单链抗体的筛选方法，其特征在于，所述的免疫抗原通过下述方法制得：将0.11mmol甘胆酸溶于1mLDMF中，加入0.22mmolDCC和0.22mmolNHS，室温下搅拌反应，离心取上清滴入5.5μmol卵清白蛋白，室温下搅拌反应，在PBS中透析得到包被抗原。7.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔锡平，吴倩，王美静，许文慧，陈泽楷，林明霞，何绮怡，杨慧怡，邹一葵，赵肃清，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：