多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的引物组合和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于多交叉扩增结合生物传感(MCDA

【技术实现步骤摘要】
多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的引物组合和检测方法
[0001]本申请是申请日为2019年03月15日、申请号为201910199719.5、专利技术名称为《多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的方法》的分案申请。


[0002]本专利技术属于分子生物学
，具体公开了多交叉扩增结合生物传感(MCDA
‑
LFB)检测结核分枝杆菌复合群用引物组合和检测方法。

技术介绍

[0003]结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和卡介苗，其中人类感染的结核病90％以上为结核分枝杆菌所致。结核病是严重危害人类健康的重要传染性疾病，结核病的早期鉴别诊断是决定病人临床结局的重要因素。
[0004]目前结核病的检测手段主要包括涂片、培养，以及以PCR为基础的诊断技术(如XpertMTB/RIF，LAMP，荧光PCR技术，荧光PCR熔解曲线法等)。涂片检测的阳性率低，尤其是在儿童中，敏感性低于15％。培养是结核病检测的金标准，敏感性约为50％，但是需时较长，改良罗氏固体培养法需4～6周，快速液体培养法需1～3周，且操作复杂，对实验室要求高，限制了其结果对临床的指导意义。近年来，随着分子生物学技术的发展和普及，越来越多的分子生物学方法被用于结核病的快速检测，如Xpert MTB/RIF和环介导恒温扩增(LAMP)是WHO推荐的结核病快速诊断方法。但前者依赖于昂贵的仪器和耗材，后者的结果判读主要依赖于反应体系颜色变化，在载菌量少的标本中，容易出现结果不易判定的情况。其它荧光PCR相关技术也都依赖于昂贵的仪器设备、探针合成和熟练的操作人员。因此，上述因素限制了这些技术在不发达地区的推广和应用。研发一个省时省力、特异性好、敏感性高的结核病快速检测方法，同时该方法又不依赖于昂贵的仪器设备和苛刻的实验条件，成为临床上的迫切需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于将MCDA
‑
LFB技术用于MTBC的检测，针对MTBC的特异基因IS6110和IS1081设计了MCDA扩增引物，进行联合检测，旨在验证、评价MCDA
‑
LFB技术及建立针对MTBC的快速、敏感和特异的MCDA
‑
LFB检测体系。
[0006]基于上述目的，本专利技术首先提供了一种多交叉恒温扩增结合纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
[0007](1)提取待检测样品的基因组；
[0008](2)提供序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物6110
‑
F1和序列如SEQ ID NO:2所示的置换引物6110
‑
F2，提供序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物6110
‑
CP1和序列如SEQ IDNO:4所示的交叉引物6110
‑
CP2；提供序列如SEQ ID NO:5所示的，并在5
’
端标记半抗原的
扩增引物6110
‑
C1*和序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物6110
‑
C2，序列如SEQ ID NO:7所示的扩增引物6110
‑
D1和序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物6110
‑
D2，序列如SEQ ID NO:9所示的扩增引物6110
‑
R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物6110
‑
R2(该组引物序列是针对MTBC的特异基因IS6110设计的)，和/或
[0009]提供序列如SEQ ID NO:11所示的置换引物1081
‑
F1和序列如SEQ ID NO:12所示的置换引物1081
‑
F2，提供序列如SEQ ID NO:13所示的交叉引物1081
‑
CP1和序列如SEQ IDNO:14所示的交叉引物1081
‑
CP2；提供序列如SEQ ID NO:15所示的，并在5
’
端标记半抗原的扩增引物1081
‑
C1*和序列如SEQ ID NO:16所示的扩增引物1081
‑
C2，序列如SEQ ID NO:17所示的扩增引物1081
‑
D1和序列如SEQ ID NO:18所示的扩增引物1081
‑
D2，序列如SEQ IDNO:19所示的扩增引物1081
‑
R1和序列如SEQ ID NO:20所示的扩增引物1081
‑
R2(该组引物序列是针对MTBC的特异基因IS1081设计的)；
[0010](3)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；
[0011](4)使用纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。
[0012]在一个优选的实施方案中，在所述扩增引物6110
‑
C1*和/或1081
‑
C1*的5
’
端所标记的半抗原为异硫氰酸荧光素(FITC)。
[0013]在一个更为优选的实施方案中，所述纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、纳米分子垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在纳米分子垫、检测线及控制线区域依次包被有高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。
[0014]在另一个优选的实施方案中，所述恒温扩增是在65
‑
68℃的环境中进行的。
[0015]在一个更为优选的实施方案中，所述恒温扩增是在67℃的环境中进行的。
[0016]在又一个优选的实施方案中，所述恒温扩增的时间为30分钟。
[0017]其次，本专利技术还提供了一组用于恒温扩增MTBC的IS6110的引物，该组引物是针对MTBC的特异基因IS6110设计的，所述引物包括：序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物6110
‑
F1和序列如SEQ ID NO:2所示的6110
‑
F2，提供序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物6110
‑
CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的6110
‑
CP2；提供序列如SEQ ID NO:5所示的，并在5
’
端标记半抗原的扩增引物6110
‑
C1*和序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物6110
‑
C2，序列如SEQ IDNO:7所示的扩增引物6110
‑
D1和序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物6110
‑
D2，序列如SEQ ID NO:9所示的扩增引物6110
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括置换引物、交叉引物和扩增引物；所述置换引物包括序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物6110
‑
F1和序列如SEQ ID NO:2所示的置换引物6110
‑
F2；和/或序列如SEQ ID NO:11所示的置换引物1081
‑
F1，和序列如SEQ ID NO:12所示的置换引物1081
‑
F2所述交叉引物包括序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物6110
‑
CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的交叉引物6110
‑
CP2；和/或序列如SEQ ID NO:13所示的交叉引物1081
‑
CP1和序列如SEQ ID NO:14所示的交叉引物1081
‑
CP2所述扩增引物包括序列如SEQ ID NO:5所示的，并在SEQ ID NO:5所示序列的5
’
端标记半抗原的扩增引物6110
‑
C1*，序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物6110
‑
C2，序列如SEQ ID NO:7所示的扩增引物6110
‑
D1，序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物6110
‑
D2，序列如SEQ ID NO:9所示的扩增引物6110
‑
R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物6110
‑
R2；和/或序列如SEQ ID NO:15所示的，并在SEQ ID NO:15所示序列的5
’
端标记半抗原的扩增引物1081
‑
C1*，序列如SEQ ID NO:16所示的扩增引物1081
‑
C2，序列如SEQ ID NO:17所示的扩增引物1081
‑
D1，序列如SEQ ID NO:18所示的扩增引物1081
‑
D2，序列如SEQ ID NO:19所示的扩增引物1081
‑
R1和序列如SEQ ID NO:20所示的扩增引物1081
‑
R2。2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，在所述扩增引物6110
‑
C1*和/或1081
‑
C1*的5
’
端所标记的半抗原为异硫氰酸荧光素。3.权利要求1或2所述的引物组合在制备检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒中的应用。4.一种基于非诊断目的的多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的基因组；(2)提供权利要求1或2所述的引物组合；(3)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、步骤(2)引物存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；(4)使用纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述纳米生物传感器包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：申阿东，焦伟伟，孙琳，王亚翠，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京儿童医院，
类型：发明
国别省市：