一种培养基组合及利用其生产Nanog蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种培养基组合及利用其生产Nanog蛋白的方法。所述培养基组合包括发酵培养基、补料培养基1和补料培养基2；所述方法使用发酵培养基发酵培养重组大肠杆菌，并在培养过程中根据DO值流加补料培养基1和补料培养基2；所述重组大肠杆菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的Nanog蛋白。本发明专利技术所述的方法克服了可溶性表达Nanog蛋白产量较低的缺陷。服了可溶性表达Nanog蛋白产量较低的缺陷。

【技术实现步骤摘要】
一种培养基组合及利用其生产Nanog蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程及微生物发酵
，涉及一种培养基组合及利用其发酵重组大肠杆菌来生产Nanog蛋白的方法。

技术介绍

[0002]Nanog蛋白有NK家族基因Nanog编码，Nanog是近年来胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)中发现的最重要的转录因子，是ESC多能性的关键主调节剂。Nanog与ESC的自我更新及其未分化状态的维持具有非常密切的关系，无论小鼠还是人的ESC转录调控，都以Oct4、Sox2和Nanog这3个转录因子为核心。这3个调控因子，缺少任何一个，ESC都会发生分化，它们都是维持ESC特性必须的。其中Sox2属于高泳动类非组蛋白盒结构域蛋白，Nanog和Oct4属于同源盒结构域蛋白。Sox2是通过保持Oct4的适当表达水平稳定ESC的多能性，而Nanog和Oct4主要通过阻断ESC的分化维持多能性。
[0003]Nanog是多能胚胎干细胞(escs)的三个转录因子主调控因子之一，它可诱导肿瘤组织内的癌细胞原位表观遗传重编程为瞬时诱导多能干细胞(tipscs)，从而重新获得分化潜能。
[0004]利用Nanog蛋白和另外两种蛋白共同作用，将癌细胞转化为正常组织细胞作为一种新的癌症治疗的作用机制，相比传统的治疗方式如化疗、放疗、免疫治疗等，对人体伤害更小。
[0005]目前生产Nanog蛋白方式主要为利用重组大肠杆菌可溶性表达。采用可溶性表达保留了蛋白活性，但是重组大肠杆菌无法做到高密度培养，产量较低。

技术实现思路

[0006]本专利技术所需要解决的技术问题是克服现有技术中可溶性表达无法高密度培养，产量较低的缺陷，本专利技术提供一种培养基组合及利用其发酵重组大肠杆菌来生产Nanog蛋白的方法。使用本专利技术所述的方法进行高密度发酵表达Nanog蛋白产量较可溶性表达提高几十倍。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]本专利技术的技术方案的第一方面提供一种培养基组合，其除包括发酵培养基外，还包括补料培养基1和/或补料培养基2；
[0009]所述发酵培养基包括：酵母粉6g/L，蛋白胨12g/L，玉米浆干粉2g/L，大豆蛋白粉2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，碳酸氢钠1g/L，硫酸镁0.196g/L，氯化钙0.5g/L，硫酸铵3g/L，氯化钠5g/L，消泡剂0.1ml/L和微量元素母液0.4ml/L；
[0010]和，葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖中的一种或多种，浓度为10g/L；
[0011]所述补料培养基1包括：酵母粉70.5g/L，蛋白胨146.4g/L，玉米浆干粉20g/L，大豆蛋白粉20g/L，(NH4)2SO
4 5g/L，MgSO
4 5.85g/L；
[0012]所述补料培养基2包括：葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖中的一种或多种，浓度为500g/L，
例如为500g/L葡萄糖。
[0013]本专利技术的技术方案的第二方面提供一种发酵生产Nanog蛋白的方法，所述方法包括使用发酵培养基发酵培养重组大肠杆菌，并在培养过程中根据DO值流加补料培养基；所述重组大肠杆菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的Nanog蛋白，其中，
[0014]在所述Nanog蛋白诱导前：流加补料培养基，控制DO值为20
‑
30％；在所述Nanog蛋白诱导后：流加补料培养基，控制DO值为15
±
5％。
[0015]使用的补料培养基和补料工艺控制更适合重组Nanog基因的大肠杆菌高密度培养和Nanog蛋白高表达。
[0016]在本专利技术的一些实施方案中，所述发酵培养基包括酵母粉、蛋白胨、玉米浆干粉、大豆蛋白粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸铵、氯化钠、消泡剂和微量元素母液；其中，酵母粉6g/L，蛋白胨12g/L，玉米浆干粉2g/L，大豆蛋白粉2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，碳酸氢钠1g/L，硫酸镁0.196g/L，氯化钙0.5g/L，硫酸铵3g/L，氯化钠5g/L，消泡剂0.1ml/L和微量元素母液0.4ml/L；
[0017]和，葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖中的一种或多种，浓度为10g/L，所述发酵培养基的pH为6.0
‑
7.5。
[0018]本专利技术的一些实施方案中，所述方法包括以下条件的一种或多种：
[0019]所述方法包括以下条件的一种或多种：
[0020]所述的微量元素母液包括FeSO4·
7H2O、CoCl2·
6H2O、H3BO3、NaMoO4·
2H2O、ZnSO4·
7H2O、CuCl2·
2H2O、MnSO4·
H2O、CaCl2、MgSO4的一种或多种；优选为FeSO4·
7H2O 40g/L，CoCl2·
6H2O 4g/L，H3BO
3 0.5g/L，NaMoO4·
2H2O 2g/L，ZnSO4·
7H2O 2g/L，CuCl2·
2H2O 1g/L，MnSO4·
H2O 4.6g/L，CaCl
2 1g/L，MgSO
4 1g/L；
[0021]所述消泡剂为Foamdoctor F2875 Pennwhite；
[0022]所述蛋白胨包括大豆蛋白胨、胰蛋白胨和酵母蛋白胨中的一种或多种，优选酵母蛋白胨。
[0023]本专利技术的一些实施例中，所述补料培养基包括补料培养基1和补料培养基2，其中，
[0024]所述补料培养基1为酵母粉70.5g/L，蛋白胨146.4g/L，玉米浆干粉20g/L，大豆蛋白粉20g/L，(NH4)2SO
4 5g/L，MgSO
4 5.85g/L；和/或，
[0025]所述补料培养基2包含葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖中的一种或多种，浓度为500g/L；优选所述蛋白胨包括大豆蛋白胨、胰蛋白胨和酵母蛋白胨中的一种或多种，更优选为酵母蛋白胨。
[0026]在本专利技术中，所述发酵培养的条件选自以下的一种或多种：
[0027]通气量0.5
‑
2vvm，搅拌转速50
‑
800rpm；
[0028]发酵培养的温度为37℃；
[0029]在所述Nanog蛋白诱导前：流加补料培养基控制DO在≥20％例如20
‑
30％；其中，补料培养基1流加速率为0.2ml/min/L，补料培养基2流加速率为0.6ml/min/L。
[0030]在所述Nanog蛋白的诱导后：流加补料培养基控制DO值为15
±
5％；其中，补料培养基1流加速率为0.2ml/min/L，补料培养基2流加速率为0.3ml/min/L；和/或，当发酵液中OD
600
值为30
‑
60时加入诱导剂；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养基组合，其特征在于，所述培养基组合除包括发酵培养基外，还包括补料培养基1和/或补料培养基2；所述发酵培养基包括：酵母粉6g/L，蛋白胨12g/L，玉米浆干粉2g/L，大豆蛋白粉2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，碳酸氢钠1g/L，硫酸镁0.196g/L，氯化钙0.5g/L，硫酸铵3g/L，氯化钠5g/L，消泡剂0.1ml/L和微量元素母液0.4ml/L；和，葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖中的一种或多种，浓度为10g/L；所述补料培养基1包括：酵母粉70.5g/L，蛋白胨146.4g/L，玉米浆干粉20g/L，大豆蛋白粉20g/L，(NH4)2SO
4 5g/L，MgSO
4 5.85g/L；所述补料培养基2包括：葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖中的一种或多种，浓度为500g/L。2.一种发酵生产Nanog蛋白的方法，其特征在于，使用发酵培养基发酵培养重组大肠杆菌，并在培养过程中根据DO值流加补料培养基；所述重组大肠杆菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的Nanog蛋白；其中，在所述Nanog蛋白的诱导前：流加补料培养基，控制DO值为20
‑
30％；在所述Nanog蛋白的诱导后：流加补料培养基，控制DO值为15
±
5％。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括酵母粉、蛋白胨、玉米浆干粉、大豆蛋白粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸铵、氯化钠、消泡剂和微量元素母液；其中，酵母粉6g/L，蛋白胨12g/L，玉米浆干粉2g/L，大豆蛋白粉2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，碳酸氢钠1g/L，硫酸镁0.196g/L，氯化钙0.5g/L，硫酸铵3g/L，氯化钠5g/L，消泡剂0.1ml/L和微量元素母液0.4ml/L；和，葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖中的一种或多种，浓度为10g/L；所述发酵培养基的pH为6.0
‑
7.5。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下条件的一种或多种：所述的微量元素母液包括FeSO4·
7H2O、CoCl2·
6H2O、H3BO3、NaMoO4·
2H2O、ZnSO4·
7H2O、CuCl2·
2H2O、MnSO4·
H2O、CaCl2、MgSO4的一种或多种；优选为FeSO4·
7H2O 40g/L，CoCl2·
6H2O 4g/L，H3BO
3 0.5g/L，NaMoO4·
2H2O 2g/L，ZnSO4·
7H2O2g/L，CuCl2·
2H2O 1g/L，MnSO4·
H2O 4.6g/L，CaCl
2 1g/L，MgSO
4 1g/L；所述的消泡剂为Foamdoctor F2875 Pennwhite；所述的蛋白胨包括大豆蛋白胨、胰蛋白胨和酵母蛋白胨中的一种或多种，优选酵母蛋白胨。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述补料培养基包括补料培养基1和补料培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：褚式彪，李倩倩，王建军，
申请(专利权)人：苏州复恩特药业有限公司，
类型：发明
国别省市：