一种维兰特罗中间体的酶催化制备方法技术

本发明专利技术公开了一种维兰特罗中间体的酶催化制备方法，所述维兰特罗中间体为(R)

【技术实现步骤摘要】
一种维兰特罗中间体的酶催化制备方法


[0001]本专利技术属于制药工业生物合成
，具体涉及一种维兰特罗中间体——(R)
‑
叔丁基(2
‑
(2,2
‑
二甲基
‑
4H
‑
苯并[D] [1,3]二噁英
‑6‑
基)
‑2‑
羟乙基)的酶催化制备方法。

技术介绍

[0002]（R）
‑
叔丁基(2
‑
(2,2
‑
二甲基
‑
4H
‑
苯并[D] [1,3]二噁英
‑6‑
基)
‑2‑
羟乙基)，英文名称：CarbaMicacid,[(2R)
‑2‑
(2,2
‑
diMethyl
‑
4H
‑
1,3
‑
benzodioxin
‑6‑ꢀ
yl)
‑2‑
hydroxyethyl]‑
,1,1
‑
diMethylethyl ester，CAS号：452339
‑
72
‑
9，分子量：323.38，是合成治疗慢性阻塞性肺病药物维兰特罗、左沙丁胺醇、沙美特罗的关键手性中间体，化学结构如下：。
[0003]目前制备该手性中间体的工艺技术主要是化学方法，还没有酶催化方法的报道。化学法主要通过Corey
‑r/>Bakshi
‑
Shibata反应实现，具体工艺路线如下：。
[0004]Corey
‑
Bakshi
‑
Shibata反应，简称CBS还原，也称为Itsuno
‑
Corey还原，是将酮还原成手性醇的一个重要的有机合成手段；与之对应的羰基还原酶（KRED）制备手性醇的工艺也越来越成熟，在依帕列净、瑞舒伐他汀、阿托伐他汀钙等药物的重要手性中间体制备中应用非常成功。
[0005]文献（Organic & Biomolecular Chemistry, 1 (7), 1106
‑
1111, 2003）在5 ℃下反应2 h，收率99%，测得R构型98%，S构型2%；专利WO2014041565A2中在
‑
10 ℃反应1 h，收率70%，手性纯度R构型97.8%，S构型2.2%；文献（中国医药工业杂志，2020, 51（10）1262
‑
1265.）在
‑
12 ℃下反应2 h，收率92%，化学纯度99.45%，手性ee值99.31%。
[0006]但是以上工艺路线都有以下缺陷：（1）反应条件苛刻，都需要较低的温度；（2）反应过程放热剧烈，温度控制困难，即使微通道反应器有良好的散热性能，也受设备昂贵及处理量微小的制约难以普及；（3）都用到（R）
‑
Me
‑
CBS这种较为昂贵的手性化学反应试剂，后处理的污水处理代价也比较高，使手性中间体的制备成本居高不下，配合微通道更是需要额外的设备支出，且手性纯度普遍不高。
[0007]酶催化属于合成生物学的应用范畴，其反应条件温和，通常是常温常压，而其催化的产物ee值可能达到99%以上，避免了重金属催化剂的使用。目前，酶催化由于其绿色、安全、环保等优点，越来越多的药物或者中间体通过酶催化的方式来合成。

技术实现思路

[0008]为了克服现有技术存在的上述缺陷以及让手性纯中间体制备更方便的工业化，本专利技术公开了一种维兰特罗中间体——(R)
‑
叔丁基(2
‑
(2,2
‑
二甲基
‑
4H
‑
苯并[D] [1,3]二噁英
‑6‑
基)
‑2‑
羟乙基)的酶催化制备方法。
[0009]根据本专利技术公开的一种(R)
‑
叔丁基(2
‑
(2,2
‑
二甲基
‑
4H
‑
苯并[D] [1,3]二噁英
‑6‑
基)
‑2‑
羟乙基)的酶催化制备方法，具体路线如下：。
[0010]在基因数据库NCBI中，通过数据比对挖掘到一个来源于Exiguobacterium sp.的羰基还原酶(命名为羰基还原酶Esp)，其NCBI登录号为WP_023468191.1。通过第三方公司优化其密码子后合成基因，将基因连接表达载体pET
‑
21a后再转入BL21(DE3)，从而构建好表达羰基还原酶Esp的宿主菌株。羰基还原酶Esp的核酸序列见SEQ ID NO:1; Esp氨基酸序列为SEQ ID NO:2。其应用的生物技术是本领域的通用技术，本专利技术不再重复描述。
[0011]本专利技术所述羰基还原酶Esp的宿主菌株的发酵表达方法，包括以下步骤：首先将所述重组表达载体转化到宿主细胞，涂布在含有50 μg/mL氨苄的LB平板上，37 ℃过夜培养后，从中挑选阳性菌落接种到50 mL液体LB培养基中进行培养；培养4 h后，吸取10 mL种子液转入1 L新鲜的LB液体培养基；当培养的浓度达到OD
600
0.6
‑
1.0时，加入终浓度为0.05
‑
1.0 mmol/L的异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导，诱导温度为16
‑
35℃，诱导培养为8
‑
16 h，诱导培养后通过离心或浓缩得到更高浓度的湿菌体，经过超声波破碎或者高压均质机破碎后离心收集上清液，即为羰基还原酶Esp的粗酶液。
[0012]本专利技术采用的酶催化技术方案如下：将缓冲液、葡萄糖、酮还原酶Esp、葡萄糖脱氢酶GDH（购自sigama）,辅酶因子NADP
+
、底物TM5：N
‑
(2
‑
(2,2
‑
二甲基
‑
4H
‑
1,3
‑
苯并二噁英
‑6‑
基)
‑2‑
氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯按照一定的比例混合，碳酸钠调节pH = 7.0
ꢀ±ꢀ
0.5、温度为29
ꢀ±ꢀ
1 ℃下反应6
‑
24 h得到产物。反应混合物中羰基还原酶Esp酶液的浓度为5～50 g/L；底物TM5：N
‑
(2
‑
(2,2
‑
二甲基
‑
4H
‑
1,3
‑
苯并二噁英
‑6‑
基)
‑2‑
氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯的浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶Esp，其特征在于：所述羰基还原酶Esp为由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的多肽。2.一种编码权利要求1所述羰基还原酶Esp的核酸，其特征在于：所述核酸为由SEQ ID NO: 1所示的DNA序列组成。3.一种重组羰基还原酶Esp的宿主菌株，其特征在于，通过发酵培养制备获得权利要求1所述的羰基还原酶Esp。4.根据权利要求1所述羰基还原酶Esp的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（a）将羰基还原酶Esp的宿主菌株涂布在含有50 μg/mL氨苄的LB平板上，37℃过夜培养后，从中挑选阳性菌落接种到50 mL液体LB培养基中进行培养；培养4 h后，吸取10 mL种子液转入1 L新鲜的LB液体培养基；（b）当培养的浓度达到OD
600
0.6
‑
1.0时，加入终浓度为0.05~1.0 mmol/L的异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷进行诱导，诱导温度为16
‑
35 ℃，诱导培养为8
‑
16 h，诱导培养后通过离心或浓缩得到更高浓度的湿菌体，经过超声波破碎或者高压均质机破碎后离心收集上清液，即为羰基还原酶Esp的酶液。5.一种(R)
‑
叔丁基(2
‑
(2,2
‑
二甲基
‑
4H
‑
苯并[D] [1,3]二噁英
‑6‑
基)
‑2‑
羟乙基) TM6的酶催化制备方法，其特征在于：将缓冲液、葡萄糖、粗酶液、辅酶因子NADP
+
、底物TM5：N
‑
(2
...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮班锋，许坤，王红磊，高大舟，
申请(专利权)人：合肥学院，
类型：发明
国别省市：