一种樱花耐涝基因的筛选方法及其在耐涝樱花品种或砧木中的应用技术

本发明专利技术提供了一种樱花耐涝基因的筛选方法，其包括水胁迫试验、RNA提取、文库构建、测序、原始数据的处理、拼接以及基因的功能注释、差异表达基因分析和实时荧光定量分析，本发明专利技术还提供了所述筛选方法筛选得到的樱花耐涝基因的应用。通过本发明专利技术可以解决樱花种植不耐涝等问题，挖掘出的抗涝基因对樱花分子育种有一定的指导意义。定的指导意义。

【技术实现步骤摘要】
一种樱花耐涝基因的筛选方法及其在耐涝樱花品种或砧木中的应用


[0001]本专利技术涉及基因筛选
，具体而言，涉及一种樱花耐涝基因的筛选方法及其在耐涝樱花品种或砧木中的应用。

技术介绍

[0002]樱花是樱属(Cerasus)植物的统称，全世界约150种，分布较广泛，亚洲、欧洲、北美洲均有分布、记录，其中我国约有50种，远超日本等其他国家和地区。目前，樱花公认为起源于我国喜马拉雅山地区，然而对观赏类樱花的开发与利用却以日本最为成功，日本至今已培育出多种冠绝世界的品种，如染井吉野(Cerasus yedoensis)、河津樱(Cerasus campanulata
‘
Kawazu
‑
zakura
’
)、大岛樱(Cerasus speciosa)和关山樱(Cerasus serrulata
‘
Kanzan
’
)等。
[0003]我国是樱花种植和消费大国，其中宁波樱花苗木种植面积占全国总面积的15％以上，是名副其实的“樱花之乡”，目前已形成了以四明山地区(余姚、奉化、鄞州交界区)为主的樱花生产基地，每年都有大量的樱花苗木被销往国内外市场。随着“樱花热”的持续，使得樱花广泛应用于景区、公园、庭院、小区等地。然而我国种植和应用的樱花均为日本品种，在宁波等南方地区，生产上使用“草樱”作为砧木，但该砧木虽易繁殖，但抗捞、抗病较差，使得樱花寿命大打折扣，此外，宁波等南方沿海地区每年受台风影响容易大面积积水，樱花更容易受涝害影响，导致其生长受阻甚至大面积死亡现象。因此，亟需寻找出一种适合我国南方种植抗涝樱花砧木。
[0004]然而野外调查发现有些特殊生境条件下的樱属种质资源(沼生矮樱)能够在含水量较高的沼泽地中生存，其抗涝性能远远大于一般樱花，但该物种植株矮小，长势慢，不适合作为砧木予以使用，然而可以通过现代生物学技术挖掘其抗涝基因，再将抗涝基因通过转基因技术导入到长势好、亲和性广泛的优良砧木(华中樱砧木、山樱砧木等)中，这样就可以解决困扰樱花种植过程中的不耐涝的问题，大大拓展樱花在低洼区域的种植范围。
[0005]近年来，植物耐淹涝性状及其机理的研宄取得了长足的进展，尤其是在水稻、玉米、豆类、麦类作物和模式植物拟南芥上，相继分离和鉴定了一些与耐涝性有关的基因，如植物AP2/ERF类转录因子基SUB1(Submergence 1)、HRE(Hypoxia responsive ERF genes)以及植物类钙调神经磷酸酶B亚基互作蛋白激酶基因CIPK(calcineurin B
‑
like
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interacting protein kinase)，被证实在水稻和拟南芥耐淹涝胁迫中发挥重要作用，为植物耐涝性的分子调控奠定了重要基础，也为其它作物耐涝机理的深入研究提供了重要参考。此外，研究表明，α
‑
淀粉酶(α
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Amylase,RAMYs)和蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SUSs)的部分基因在缺氧条件下受糖饥饿或能量缺乏诱导表达，与植物耐涝能力密切相关。耐涝植物通过调节乙醇脱氧酶(Alcohol dehydrogenase,ADHs)和丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDCs)等基因表达，增强乙醇发酵速率，促进ATP的生成，被认为是提高植物耐涝能力的有效方法。植物根系生长发育、细胞组织生长等过程与扩张蛋白基因
(Expansin,EXPs)的表达紧密相关。淹涝胁迫下，耐涝水稻品种地上部分组织中EXPs基因的表达受到抑制，从而抑制细胞伸长与植株生长，减缓能量消耗维持植株成活。
[0006]目前，我国樱花野生资源除了“钟花樱”等个别种质资源有规模化繁育外，其余资源尚未得到有效开发。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是提供一种樱花耐涝基因的筛选方法，以解决目前樱花的耐涝能力一般，从而抑制细胞伸长与植株生长，减缓能量消耗维持植株成活的问题，筛选得到耐涝性强的基因。
[0008]为解决上述问题，本专利技术提供一种樱花耐涝基因的筛选方法，包括以下步骤：
[0009]S1：水胁迫试验：选取樱花种子播种，待种子发育生长为小苗长出真叶后进行水胁迫试验，水胁迫试验后采集健康无病害叶片放入液氮中速冻，随后置于
‑
80℃的环境下保存；
[0010]S2：RNA提取、文库构建、测序：
[0011]利用Trizol法提取步骤S1保存叶片的总RNA，将所述总RNA经过DNase处理后，富集mRNA，然后利用打断试剂在室温下将所述mRNA分成小片段，再以所述小片段反转录得到第一链cDNA，随后利用第二链反应反应体系合成得到第二链cDNA，将得到的双链cDNA纯化后进行PCR扩增得到cDNA文库，并对其测序；
[0012]S3：原始数据的处理、拼接：
[0013]将步骤S2测序得到的原始数据去除接头序列、低质量读段以及过短序列后得到高质量的质控数据，对所述质控数据与参考基因组进行比对，得到用于后续转录本组装、表达量计算的映射数据，将所述映射数据拼接后进行组装，再次与参考基因组比对，并构建位点图，最后保留覆盖率高的路径，组装得到转录本，完成筛选。
[0014]作为优选的方案，所述步骤S1中，所述选取樱花种子包括以下步骤：采集樱花种子后，将种子经过清洗、晾干、完成后熟后置于阴暗处，之后将种子与湿河沙混合后冷藏。
[0015]作为优选的方案，所述步骤S1中，所述种子与湿河沙的质量配比为1:1，且所述冷藏的条件是置于4℃的冰箱中冷藏2～3个月。
[0016]作为优选的方案，所述步骤S1中，所述水胁迫试验的条件如下：对樱花种子进行定期浇水，每次浇水的量以容器底部快速滴水为准，进行多次试验。
[0017]作为优选的方案，所述步骤S2中，所述富集mRNA的方法为采用带有Oligo
‑
dT的磁珠富集m RNA，所述测序采用的设备为Illumina测序仪。
[0018]作为优选的方案，所述步骤S3后还包括步骤S4：基因的功能注释，所述步骤S4包括以下步骤：将步骤S3得到的转录本与数据库进行比对，选取与所述转录本有最高系列相似性的蛋白，作为所述转录本的蛋白功能注释信息。
[0019]作为优选的方案，所述步骤S4后还包括步骤S5：基因分析，所述步骤S5包括差异表达基因分析以及实时荧光定量PCR分析。
[0020]作为优选的方案，所述差异表达基因分析的条件为：采用FPKM作为基因表达水平的指标，根据基因的表达量计算基因在不同样本间的差异表达倍数，以|log
2 Fold Change|≥2且P
‑
value≤0.05作为阈值，错误发现率＜0.01作为差异基因筛选标准。
[0021]作为优选的方案，所述实时荧光定量PCR分析的主要参数为:GC含量30％～60％，退火温度52～60℃，引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种樱花耐涝基因的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：水胁迫试验：选取樱花种子播种，待种子发育生长为小苗长出真叶后进行水胁迫试验，水胁迫试验后采集健康无病害叶片放入液氮中速冻，随后置于
‑
80℃的环境下保存；S2：RNA提取、文库构建、测序：利用Trizol法提取步骤S1保存叶片的总RNA，将所述总RNA经过DNase处理后，富集mRNA，然后利用打断试剂在室温下将所述mRNA分成小片段，再以所述小片段反转录得到第一链cDNA，随后利用第二链反应反应体系合成得到第二链cDNA，将得到的双链cDNA纯化后进行PCR扩增得到cDNA文库，并对其测序；S3：原始数据的处理、拼接：将步骤S2测序得到的原始数据去除接头序列、低质量读段以及过短序列后得到高质量的质控数据，对所述质控数据与参考基因组进行比对，得到用于后续转录本组装、表达量计算的映射数据，将所述映射数据拼接后进行组装，再次与参考基因组比对，并构建位点图，最后保留覆盖率高的路径，组装得到转录本，完成筛选。2.根据权利要求1所述的樱花耐涝基因的筛选方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述选取樱花种子包括以下步骤：采集樱花种子后，将种子经过清洗、晾干、完成后熟后置于阴暗处，之后将种子与湿河沙混合后冷藏。3.根据权利要求2所述的樱花耐涝基因的筛选方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述种子与湿河沙的质量配比为1:1，且所述冷藏的条件是置于4℃的冰箱中冷藏2～3个月。4.根据权利要求1所述的樱花耐涝基因的筛选方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述水胁迫试验的条件如下：对樱花种子进行定期浇水，每次浇水的量以容器底部快速滴水为准，进行多次试验。5.根据权利要求1所述的樱花耐涝基因的筛选方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述富集mRNA的方法为采用带有Oligo
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dT的磁珠富集mRNA，所述测序采用的设备为Illumina测序仪。6.根据权利要求1所述的樱花耐涝基因的筛选方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：付涛，王志龙，李文，蒋劢博，
申请(专利权)人：宁波城市职业技术学院，
类型：发明
国别省市：