一种鉴定植物体内转录因子结合位点的方法及应用技术

本申请公开了一种鉴定植物体内转录因子结合位点的方法及应用，该方法为tsCUT&Tag，其步骤包括：构建转录因子瞬时表达的细胞；对转录因子瞬时表达的细胞进行CUT&Tag操作，获得与转录因子特异结合的DNA文库；以及分析DNA文库数据获得转录因子结合位点信息。该方法在传统的CUT&Tag技术上，结合了植物原生质体瞬时转化技术，不依赖于植物细胞核的提取、交联、打断等步骤，准确性高且更加节约时间，在一定程度上实现了高通量。本申请还公开了一种利用深度学习模型预测转录因子在不同组织的调控图谱，开发了基于多组数据的深度学习策略，经过机器学习可以显著提高转录因子结合位点的预测精度。测精度。测精度。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定植物体内转录因子结合位点的方法及应用


[0001]本申请涉及生物
，尤其涉及一种鉴定植物体内转录因子结合位点的方法及应用。

技术介绍

[0002]在几乎所有的细胞生命活动中，例如DNA复制，基因的表达、调控、重组和修复，RNA转录、翻译、修饰等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用。转录因子是一群能与基因5`端上有特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子，转录因子结合位点是与转录因子结合的DNA片段。针对植物来说，开发高通量鉴定转录因子结合位点的技术对于解析作物重要性状的转录调控机制具有重要的生物学意义。
[0003]染色质免疫沉淀技术(ChIP
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seq)是体内全基因组水平鉴定转录因子结合位点的经典方法，但是需要稳定转化的转基因植株或者纯化高质量特异性的抗体，步骤繁琐，耗时长，背景较高；ChIP
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seq在应用于大规模转录因子研究时，也无法实现高通量，成本较高。DNA亲和纯化测序技术(DAP
‑
seq)可以实现在体外高通量全基因组水平鉴定转录因子调控位点，但是局限在无法研究转录因子互作对下游基因的调控机制，一定程度上也无法真实反映体内转录因子与DNA的互作。近些年，利用植物瞬时表达的ChIP
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seq技术，为高通量表达转录因子蛋白和绘制转录调控网络提供了一个快速的方法(Wang et al 2021)，但是也仅限于特定组织的研究。因此，急需开发一套高效低成本高通量的体内鉴定转录因子结合位点的技术体系，来真实反应转录因子与DNA的互作，系统构建转录因子与DNA在体内的互作全景。
[0004]近些年，生物体内CUT&Tag(Cleavage under targets and tagmentationmethod，靶向剪切及转座酶技术)被成功开发出来，用于表征体内的表观修饰和基因表达调控。CUT&Tag的基本原理是在抗体引导下，ChiTag酶(Protein A蛋白与Tn5转座酶的融合蛋白)仅在目的组蛋白修饰标志、转录因子或染色质调控蛋白结合染色质的局部进行目的DNA的片段化，同时添加测序接头进行高通量测序(Kaya
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Okur et al 2019)。CUT&Tag与传统的ChIP
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Seq研究方法相比，无需交联、超声打断、末端抹平和接头连接等操作，具有省时高效、所需的样品量少、背景信号低和可重复性好等优点。但是由于植物细胞壁的存在，一定程度上限制了CUT&Tag在植物当中的应用。尽管基于细胞核提取的CUT&Tag技术已成功用于植物组蛋白修饰位点的高通量鉴定(Tao et al 2020；Ouyang et al 2021)，但是CUT&Tag技术能否用于植物体内转录因子结合位点的研究有待验证，以及一套适用于植物体内高通量低成本鉴定转录因子结合位点的方法还有待进一步开发。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本申请的目的是为了解决高通量研究植物体内转录因子结合位点技术的不足，其解决方案是在传统的CUT&Tag技术上，结合了植物原生质体瞬时转化技术，开发
了不依赖于细胞核提取的tsCUT&Tag(transientandsimplifiedCUT&Tag)技术，其具体的技术方案如下：
[0006]第一方面，本申请实施例公开了一种全新的鉴定植物体内转录因子结合位点的方法，所述方法包括以下步骤：
[0007]转录因子与绿色荧光蛋白GFP进行融合，获得转录因子瞬时表达的细胞；
[0008]对转录因子瞬时表达的细胞进行CUT&Tag操作，获得与与转录因子特异结合的DNA文库；以及
[0009]分析所述DNA文库的数据，获得转录因子结合位点信息。
[0010]进一步地，所述获得转录因子瞬时表达的细胞的过程包括以下步骤：
[0011]构建转录因子瞬时表达载体(质粒)，并转化至感受态细胞；
[0012]从感受态细胞中提取质粒；以及
[0013]原生质体的提取和转化。
[0014]进一步地，所述CUT&Tag操作包括：
[0015]将转录因子瞬时表达的细胞溶液进行刀豆蛋白A磁珠(ConAbeads)处理，收集细胞；
[0016]细胞与ConAbeads的孵育；
[0017]孵育第一抗体和第二抗体；所述第一抗体与目标蛋白(转录因子)结合，所述第二抗体与所述第一抗体结合；
[0018]孵育pA/pG
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Tn5转座子(HyperactivepG
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Tn5/pA
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Tn5Transposon)；激活转座子，进行DNA片段化；以及
[0019]文库扩增与纯化。
[0020]进一步地，所述分析所述DNA文库的数据的过程包括：
[0021](1)通过所述DNA文库原始测序数据，得到与参考基因组唯一匹配的reads；
[0022](2)通过与参考基因组唯一匹配的reads得到去除背景的reads；
[0023](3)分析去除背景的reads，获得转录因子结合位点信息。
[0024]第二方面，本申请提供了一种预测植物体内转录因子结合位点的方法，其包括：
[0025]建立深度学习模型；并针对第一植物组织的转录因子的tsCUT&Tag数据和第二植物组织的ATAC
‑
seq数据进行学习；
[0026]基于深度学习模型预测第二植物组织开放染色质区域序列(ATAC
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seq)中的转录结合位点；以及
[0027]预测结果输出。
[0028]进一步地，所述深度学习模型为长短期记忆递归神经网络，其中用于构建模型的训练集划分方法为：在染色质开放区域(ATAC
‑
seq)的结合峰(tsCUT&Tag)的上下游100bp，共200bp，属性定义为1；染色质开发区域不存在峰的结合区域，属性定义为0。
[0029]第三方面，第一方面所述方法和/或第二方面所述方法在鉴定和/或预测植物体内转录因子结合位点的应用。
[0030]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0031]本申请中涉及一种鉴定植物体内转录因子结合位点的方法及应用，所述方法为tsCUT&Tag，较传统的ChIP
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seq至少具有以下优点：
[0032]1、tsCUT&Tag是基于原生质体瞬时转化的技术，可以一定程度上实现高通量。此外，将转录因子与绿色荧光蛋白融合在植物体内进行瞬时表达，方便后续利用商业化的GFP抗体进行免疫反应，因此无需制备转录因子特异性的抗体，节约前期本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定植物体内转录因子结合位点的方法，其包括以下步骤：转录因子与绿色荧光蛋白GFP进行融合，获得转录因子瞬时表达的细胞；对转录因子瞬时表达的细胞进行CUT&Tag操作，获得与转录因子特异结合的DNA文库；以及分析所述DNA文库的数据，获得转录因子结合位点信息。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得转录因子瞬时表达的细胞的过程包括以下步骤：构建转录因子瞬时表达载体，并转化至感受态细胞；从感受态细胞中提取表达载体；以及原生质体的提取和转化。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述CUT&Tag操作包括：将转录因子瞬时表达的细胞溶液进行刀豆蛋白A磁珠处理，收集细胞；细胞与刀豆蛋白A磁珠的孵育；孵育第一抗体和第二抗体；所述第一抗体与转录因子结合，所述第二抗体与所述第一抗体结合；孵育pA/pG
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Tn5转座子；激活转座子，进行DNA片段化；文库扩增与纯化。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分析...

【专利技术属性】
技术研发人员：李林，吴雷明，罗姿，史燕妮，江宜哲，李若楠，苗馨心，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：