一种基于测序的宏基因组定量方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种用于感染宏基因组测序定量的组合物和基于测序的宏基因组定量方法，所述方法具有样本需求量低、耗时少、操作简便、成本降低等优势。成本降低等优势。成本降低等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种基于测序的宏基因组定量方法


[0001]本申请属于体外诊断
，具体而言，涉及一种基于测序的宏基因组定量方法。
技术背景
[0002]几乎所有的感染因子都包含DNA或RNA基因组，这使得测序成为病原体检测的一种有吸引力的方法。2004年以来，高通量或下一代测序的成本已经降低了几个数量级，已经成为患者临床样本检测的重要技术平台。下一代测序(NGS)，也被称为高通量或大规模并行测序，是一种允许数千到数十亿个DNA片段同时和独立测序的技术类型。NGS在临床微生物测试中的应用是多方面的，包括宏基因组NGS(mNGS)，mNGS允许一种无偏倚的方法来检测病原体。mNGS为检测临床样本中的所有病原体提供了一种敏感和彻底的方法，从传统细菌到非典型和罕见病原体均可进行快速诊断的。宏基因组分析有助于病原体的鉴定，包括细菌、真菌和病毒感染的。
[0003]随着发展需求，临床不仅注重患者的微生物感染情况，更对微生物定量的需求越来越高。目前临床使用的常规方法为血培养、核酸检测等，然而传统培养方法的局限性挑战了医生做出精确诊断和适当降低抗菌药物。非培养的方法，如核酸PCR试验，虽然可能有助于充分的诊断，但是实验周期较长，诊断成本较大。目前非培养DNA定量的方式有很多种，比如Qubit、SYBR Green、Taqman以及ddPCR。不过这些方法大多需要大量DNA来提供准确的滴定，相比而言，测序平台则仅需要微克的文库DNA即可用于定量。测序所需的DNA数量(平均每道12pM)大约比上述定量所需的少1000倍，这对于部分可能无法获得这个数量DNA的样本带来福音。基于此，提出了本申请。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本申请提出一种基于测序的宏基因组定量方法，具体而言，不申请至少包含如下目的：
[0005]本申请的第一目的是提供一种基于测序的宏基因组定量方法；
[0006]本申请的第二目的是提供一种定量产品GKSPK3。
[0007]为实现上述目的，本申请具体提出如下技术方案：
[0008]本申请提供一种用于感染宏基因组测序定量的组合物GKSPK3，所述组合物GKSPK3包含高GC含量革兰氏阴性菌A、正常GC含量的革兰氏阴性菌B和正常GC含量的革兰氏阳性菌C。
[0009]进一步的，所述革兰氏阴性菌菌株A为Halomonas xianhensis，所述革兰氏阴性菌B为Shewanella nanhaiensis，所述革兰氏阳性菌C为Jeotgalibacillus campisalis。
[0010]进一步的，所述Halomonas xianhensis、Shewanella nanhaiensis和Jeotgalibacillus campisalis的浓度配比为100
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1000:10
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100:1
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10；
[0011]进一步优选的，浓度配比为100:10:1。
[0012]本申请还提供一种用于感染宏基因组测序定量的试剂盒，包含上述任一所述的组合物GKSPK3。
[0013]本申请还提供上述组合物GKSPK3在感染宏基因组测序定量中的应用。
[0014]本申请还提供一种基于测序的感染宏基因组的定量方法，包括如下步骤：在样本mNGS的提取建库环节，添加上述任一所述的组合物GKSPK3，基于测序获得的Halomonas xianhensis，Shewanella nanhaiensis，Jeotgalibacillus campisalis的种水平原始reads计算得出各物种在该样本中的相对丰度，以相对丰度作为自变量，与已知的实际质量作为因变量，绘制线性方程；代入该样本中各物种的相对丰度求得样本中病原菌对应的理论质量，再通过公式换算求得对应病原菌物种的理论拷贝浓度。
[0015]进一步的，所述已知的实际质量是GKSPK3中各物种投入的copy值(根据dPCR定量出的copy)与基因组大小计算得GKSPK3三株深海菌的实际质量；
[0016]在一些具体的实施方式中，所述已知的实际质量计算公式为：
[0017][0018]在一些具体的实施方式中，所述线性方程为：
[0019]y＝0.2973x；
[0020]R2＝0.9999。
[0021]在一些具体的实施方式中，所述所述理论拷贝浓度计算公式如下：
[0022][0023][0024]本申请还提供一种用于感染宏基因组定量体系的建立方法，所述方法包括如下步骤：
[0025]步骤1：定量组合物GKSPK3的制备：
[0026]筛选得到革兰氏阴性菌菌株A(Halomonas xianhensis)、革兰氏阴性菌B(Shewanella nanhaiensis)和革兰氏阳性菌C(Jeotgalibacillus campisalis)，分别传代培养；通过mNGS进行纯度验证并大规模扩繁；扩繁后培养物分别进行dPCR定量，定量后按照100
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1000:10
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100:1
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10浓度比例混合制备上述任一所述的定量组合物GKSPK3；
[0027]步骤2：模拟参考盘的配制：
[0028]选取模拟参考盘的病原菌，所述病原菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母状真菌与临床常见病毒；综合临床病原菌检出水平及mNGS过程的检测限，设定模拟参考盘的人源细胞浓度和病原菌浓度，通过dPCR定量参考盘内各病原菌终浓度，建立一定浓度梯度的模拟参考盘；配制参考盘后，再通过dPCR定量参考盘内物种的实际copy浓度(即dPCR定量的结果)，验证参考盘的稳定性；
[0029]步骤3：定量模型的构建：
[0030]将定量组合物GKSPK3添加到模拟临床参考盘，共同进行DNA提取、建库并进行mNGS流程，通过测序结果中GKSPK3三种菌的各自种水平的种原始reads占比与已知三种菌的实
际质量，构建线性方程；测序获得模拟参考盘中各病原菌的种原始reads占比，根据线性方程推算模拟参考盘中各病原菌对应的理论质量，得出各病原菌的拷贝浓度(即mNGS定量结果)；再利用上述共同提取的DNA进行dPCR定量，得到模拟参考盘内各病原菌的实际拷贝浓度(即dPCR定量结果)；比较不同浓度梯度下得到的mNGS定量结果和dPCR定量结果，获得两种定量方式间的各物种换算系数；
[0031]优选的，所述方法还包括：
[0032]步骤4：换算系数的验证：
[0033]随机选取包含模拟参考盘内物种的临床样本，DNA提取建库过程中添加定量组合物GKSPK3并进行测序流程，同步骤3中的操作，计算得到拷贝浓度后通过各物种的换算系数，得到理论拷贝浓度(即mNGS定量结果)，再与dPCR结果相比，验证结果相符度。
[0034]进一步的，所述步骤2中，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，所述革兰氏阴性菌为肺炎克雷伯菌，所述酵母状真菌为白色念本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于感染宏基因组测序定量的组合物GKSPK3，其特征在于，所述组合物GKSPK3包含高GC含量革兰氏阴性菌A、正常GC含量的革兰氏阴性菌B和正常GC含量的革兰氏阳性菌C。2.根据权利要求1所述的组合物GKSPK3，其特征在于，所述革兰氏阴性菌菌株A为Halomonas xianhensis，所述革兰氏阴性菌B为Shewanella nanhaiensis，所述革兰氏阳性菌C为Jeotgalibacillus campisalis。3.根据权利要求1所述的组合物GKSPK3，其特征在于，所述Halomonas xianhensis、Shewanella nanhaiensis和Jeotgalibacillus campisalis的浓度配比为100
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1000:10
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100:1
‑
10；优选的，浓度配比为100:10:1。4.一种用于感染宏基因组测序定量的试剂盒，其特征在于包含权利要求1
‑
2任一所述的组合物GKSPK3。5.权利要求1
‑
3任一所述组合物GKSPK3在感染宏基因组测序定量中的应用。6.一种基于测序的感染宏基因组的定量方法，其特征在于，包括如下步骤：在样本mNGS的提取建库环节，添加权利要求1
‑
3任一所述的组合物GKSPK3，基于测序获得的Halomonas xianhensis，Shewanella nanhaiensis和Jeotgalibacillus campisalis的种水平原始reads计算得出各物种在该样本中的相对丰度，以相对丰度作为自变量，与已知的实际质量作为因变量，绘制线性方程；代入该样本中各物种的相对丰度求得样本中病原菌对应的理论质量，再通过公式换算求得对应病原菌物种的理论拷贝浓度。7.一种用于感染宏基因组定量体系的建立方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1：定量组合物GKSPK3的制备：筛选得到革兰氏阴性菌菌株Halomonas xianhensis、革兰氏阴性菌Shewanella nanhaiensis和革兰氏阳性菌Jeotgalibacillus campisalis，分别传代培养；通过mNGS进行纯度验证并大规模扩繁；扩繁后培养物分别进行dPCR定量，定量后按照100
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1000:10
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100:1
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10浓度比例混合制备权利要求1
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2任一所述的定量组合物GKSPK3；步骤2：模拟参考盘的配制：选取模拟参考盘的病原菌，所述病原菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母状真菌与临床常见病毒；综合临...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹德盼，肖硕，康亮亮，李杜衡，贾雪峰，蒋智，
申请(专利权)人：北京金匙医学检验实验室有限公司金匙智造天津医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：