本发明专利技术提供了一种血浆cfDNA甲基化标志物的检测方法及其应用，所述检测方法包括：提取待测样本的血浆cfDNA，将所述血浆cfDNA与内参混合物进行混合，进行末端修复；分别将来自不同待测样本的末端修复的产物连接不同的测序接头，得到连接产物并进行纯化回收；将含有不同测序接头的纯化产物混合，得到混合体系，采用磁珠修饰的MBD蛋白对混合体系中的甲基化DNA片段进行富集，洗脱收集甲基化DNA片段并进行扩增，获得扩增文库；对扩增文库进行高通量测序，筛选甲基化差异基因。所述方法以低DNA起始量、低成本、高通量、高准确度筛选肿瘤cfDNA甲基化标志物，有望进一步应用于无创、敏感且准确的早期癌症检测和癌症分类。准确的早期癌症检测和癌症分类。准确的早期癌症检测和癌症分类。
【技术实现步骤摘要】
一种血浆cfDNA甲基化标志物的检测方法及其应用
[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种血浆cfDNA甲基化标志物的检测方法及其应用。
技术介绍
[0002]DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，多数癌症均存在大量甲基化改变，在血液样本中通过评估CpG位点检测肿瘤来源的DNA。此外，cfDNA甲基化模式通常反映特定癌症的表观遗传起源，能够揭示未知原发性癌症的起源组织。因此，筛选血液cfDNA甲基化标志物在肿瘤早期检测和预后评估等临床诊治中具有重要应用价值。
[0003]血浆中cfDNA数量少、片段短，尤其是早期肿瘤释放的cfDNA有限，因此对检测要求较高。目前筛选与生物学过程相关的DNA甲基化标志物的方法主要有：全基因组甲基化测序(WGBS)、简化甲基化测序(RRBS)、甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP
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seq)等。尽管WGBS能得到全基因组范围内单碱基分辨率的甲基化信号，但亚硫酸盐处理对DNA损伤大，建库所需起始量高(微克级别)，且需要较高测序数据量，费用负担较大。而RRBS测序建库对启动子区及CpG岛区域CpG位点富集程度低(特别是对于FFPE样本)，不同样本之间位点重现性不高。MeDIP
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Seq作为一种成本相对较低的检测方法也常被用来进行临床样本的甲基化研究，但是该方法对中高CpG密度区域更加敏感，甲基化抗体稳定性难控制，整个实验操作较为繁琐。MBD
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Seq利用MBD蛋白与甲基化DNA的特异性结合并去除非甲基化DNA，该方法能够利用不同盐离子浓度选择性的将不同CpG密度的甲基化DNA特异性地富集下来，仅需对目的甲基化DNA测序即可获得甲基化差异位点。
[0004]因此，开发一种低DNA起始量、低成本、高通量、高准确度的在全基因组层面筛选cfDNA甲基化标志物的检测技术具有重要的临床意义和广阔市场前景。
技术实现思路
[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种血浆cfDNA甲基化标志物的检测方法及其应用。所述检测方法使用极低cfDNA投入量构建文库，可选择性地将多个(1
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8个)子文库混合进行富集反应，之后采用高盐洗脱降低非甲基化DNA片段，从而高效富集目标高甲基化DNA片段，提高有效目标区域的深度测序，提高检测的通量，极大地降低了检测成本，在肿瘤早期检测和预后评估等临床诊治中具有重要应用价值。
[0006]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种血浆cfDNA甲基化标志物的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
[0008]S1：提取待测样本的血浆cfDNA，将所述血浆cfDNA与内参混合物进行混合，进行末端修复；
[0009]S2：分别将来自不同待测样本的末端修复的产物连接不同的测序接头，得到连接产物并进行纯化回收；
[0010]S3：将含有不同测序接头的纯化产物混合，得到混合体系，采用磁珠修饰的MBD蛋白对混合体系中的甲基化DNA片段进行富集，洗脱收集甲基化DNA片段并进行扩增，获得扩增文库；
[0011]S4：对扩增文库进行高通量测序，筛选甲基化差异基因。
[0012]本专利技术中，所述血浆cfDNA甲基化标志物的检测方法的实施流程图如图1所示。
[0013]优选地，步骤S1中，所述血浆cfDNA与内参混合物混合的质量比例为8
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12ng血浆cfDNA(例如可以是8ng、9ng、10ng、11ng或12ng等)/10pg内参混合物。
[0014]优选地，所述内参混合物为非甲基化内参和甲基化内参的等质量混合物，所述非甲基化内参序列中的胞嘧啶均为未甲基化的胞嘧啶，所述甲基化内参序列中的胞嘧啶均为甲基化修饰的胞嘧啶。
[0015]优选地，所述非甲基化内参与甲基化内参的序列长度各自独立为100
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200bp，例如可以是100bp、110bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp或200bp等。
[0016]优选地，所述非甲基化内参的正链核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述非甲基化内参的负链核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0017]本专利技术中，非甲基化内参qPCR扩增引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3
‑
4所示。
[0018]优选地，所述甲基化内参的正链核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述甲基化内参的负链核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0019]本专利技术中，甲基化内参qPCR扩增引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:7
‑
8所示。
[0020]本专利技术中，所述内参混合物为非甲基化内参和甲基化内参的混合物，其中非甲基化内参序列中的胞嘧啶均为未甲基化(理论上不被富集)，甲基化内参序列中的胞嘧啶均为甲基化修饰(理论上全部被富集)，二者序列长度与血浆cfDNA接近，优选为166bp，均为非人源序列，其作用为通过分析测序数据中的内参序列数据来评估本专利技术所述检测方法中MBD的富集效率，亦可使用所述序列对应引物进行qPCR检测。
[0021]SEQ ID NO:1：
[0022]cggataaactattacaacccctacagtttgatgagtatagaaatggatccactcgttattctcggacgagtgttcagtaatgaacctctggagagaaccatgtatatgatcgttatctgggttggacttctgcttttaagcccagataactggcctgaatatg。
[0023]SEQ ID NO:2：
[0024]catattcaggccagttatctgggcttaaaagcagaagtccaacccagataacgatcatatacatggttctctccagaggttcattactgaacactcgtccgagaataacgagtggatccatttctatactcatcaaactgtaggggttgtaatgtttatccg。
[0025]SEQ ID NO:3：
[0026]cggataaactattacaacccc。
[0027]SEQ ID NO:4：
[0028]catattcaggccagttatctgg。
[0029]SEQ ID NO:5：
[0030]ttataatctgctggccggaactaatgaatttattggtgaaggtgacgcatatattccgcctcataccggtctgcctgcaaacagtaccgatattgcaccgccagatattccggctggctttgtggctgttttcaacagtgatgaggcatcgtggcatctcgttgaag。
[0031]SEQ ID NO:6：
[0032]ct本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种血浆cfDNA甲基化标志物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：S1：提取待测样本的血浆cfDNA，将所述血浆cfDNA与内参混合物进行混合，进行末端修复；S2：分别将来自不同待测样本的末端修复的产物连接不同的测序接头，得到连接产物并进行纯化回收；S3：将含有不同测序接头的纯化产物混合，得到混合体系，采用磁珠修饰的MBD蛋白对混合体系中的甲基化DNA片段进行富集，洗脱收集甲基化DNA片段并进行扩增，获得扩增文库；S4：对扩增文库进行高通量测序，筛选甲基化差异基因。2.根据权利要求1所述的血浆cfDNA甲基化标志物的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述血浆cfDNA与内参混合物混合的质量比例为8
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12ng血浆cfDNA/10pg内参混合物；优选地，所述内参混合物为非甲基化内参和甲基化内参的等质量混合物，所述非甲基化内参序列中的胞嘧啶均为未甲基化的胞嘧啶，所述甲基化内参序列中的胞嘧啶均为甲基化修饰的胞嘧啶；优选地，所述非甲基化内参与甲基化内参的序列长度各自独立为100
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200bp；优选地，所述非甲基化内参的正链核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述非甲基化内参的负链核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；优选地，所述甲基化内参的正链核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述甲基化内参的负链核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。3.根据权利要求1所述的血浆cfDNA甲基化标志物的检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述纯化回收采用磁珠对连接产物进行纯化回收，所述纯化回收过程中磁珠和连接产物的体积比为(0.6～0.8):1。4.根据权利要求1所述的血浆cfDNA甲基化标志物的检测方法，其特征在于，步骤S3中，对混合体系中的甲基化DNA片段进行富集的过程中，每200μL富集体系中含有1
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8种样本进行混合，每种样本须有一种对应的测序接头；优选地，所述富集的时间为1
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2h，所述富集的温度为20
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25℃。5.根据权利要求1所述的血浆cfDNA甲基化标志物的检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述洗脱收集甲基化DNA片段采用如下步骤进行：分别采用离子浓度依次升高的洗脱缓冲液对富集后的...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄晓东，汤郡，王大庆，张亚飞，
申请(专利权)人：迈杰转化医学研究苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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