用于直接检测多个样本中BCR-ABL1融合基因启动子甲基化的试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术提供一种用于直接检测多个样本中BCR

【技术实现步骤摘要】
用于直接检测多个样本中BCR
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ABL1融合基因启动子甲基化的试剂盒及使用方法


[0001]本专利技术涉及DNA化学修饰检测
，特别涉及一种用于直接检测多个样本中BCR
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ABL1融合基因启动子甲基化的试剂盒及使用方法。

技术介绍

[0002]BCR
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ABL1融合基因是由t(9:22)(q34:11)易位形成，见于90％以上CML、25～30％成人ALL、3％～5％儿童ALL以及少数AML患者，其表达的融合产物具有组成性酪氨酸激酶活性，从而导致不受控的细胞增殖。针对BCR
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ABL融合蛋白的致癌机制开发的分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂(一代TKIs伊马替尼)极大地改善了BCR
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ABL1阳性患者的治疗和预后，并使得BCR
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ABL1融合阳性的CML和ALL成为了可控的慢性疾病。但在治疗过程中，一些患者仍然表现出对TKIs治疗的耐药，其中BCR
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ABL1依赖性的耐药机制最为多见，包括ABL1激酶结构域(KD)突变、BCR
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ABL1过表达和BCR
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ABL1分子上的表观遗传修饰改变。尽管KD突变和BCR
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ABL过表达是被研究最多的耐药机制，并直接引导了后续二代(尼洛替尼、达沙替尼、博苏替尼)和三代(博纳替尼)TKIs的研发和应用，但仍有许多病人对二代或三代TKIs治疗不敏感。因此研究其他的耐药机制对于开发新的治疗策略意义重大，例如目前正在研究针对BCR
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ABL1启动子甲基化异常的表观遗传修饰改变的耐药患者是否可以考虑使用去甲基化药物(地西他滨)等新的治疗策略。
[0003]DNA甲基化是DNA表观遗传学领域最重要的研究内容之一，其中在哺乳动物基因组中丰度最高、亦是被研究最为成熟的修饰类型是DNA胞嘧啶第五位碳原子上的甲基化，即5
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甲基胞嘧啶(5
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methylcytosine,5mC)修饰。5mC在人类基因组中约占1％，主要发生在基因组中分布不均匀的CpG(C
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胞嘧啶、p
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磷酸、G
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鸟嘌呤)二核苷酸位点中，尤其富含CpG二核苷酸的基因启动子区域的一段DNA片段(CpG岛)。已有大量研究表明，DNA上的5mC修饰是一种抑制基因转录的稳定表观遗传标记物，其水平的维持和改变在个体发育、基因表达调控、机体衰老等过程中发挥重要功能，而其异常改变则与多种疾病，特别是癌症的发生、发展密切相关。在癌组织中，DNA甲基化的异常模式普遍是基因组大范围低甲基化和某些抑癌基因的启动子等局部区域的CpG岛(正常组织中呈现非甲基化状态)的高甲基化，例如异常的低甲基化会引起致癌基因的过度表达，而高甲基化则会导致肿瘤抑制基因的失活，即基因沉默。BCR
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ABL1融合基因作为多种白血病发生的驱动因素，其表达主要受BCR基因启动子的调控，因为有研究表明ABL1基因的一个保守的启动子Pa虽然也存在于BCR
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ABL1融合基因当中，但是该启动子的高甲基化水平与相关的疾病状态无关。此外，一项关于CML患者的BCR基因启动子甲基化水平与伊马替尼疗效相关性研究还表明，BCR启动子DNA甲基化增加表明患者预后良好，且对伊马替尼的反应性更好。但目前针对于BCR
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ABL1启动子甲基化异常是否影响BCR
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BAL1基因表达和因BCR
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ABL1启动子甲基化异常而耐药的患者是否对去甲基化药物敏感的大数据研究并不多，其中很大的一个因素在于目前传统的5mC检测技术不能同时兼顾检测技术的简便性、特异性、通量和数据分析的简易性。
[0004]5mC的检测过程大致可分为样本的预处理和测序这两步。预处理的方式主要包括酶识别法、化学转化法和抗体富集法，其中基于亚硫酸氢盐的化学转化法是最可靠且应用最广泛的样本处理方式。基于亚硫酸氢盐转化的测序技术的基本原理是利用化学试剂亚硫酸氢盐将未甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，但不改变5mC和其他DNA碱基，由此将5mC和C区分开，最后再通过第一代或二代测序技术即可得到的DNA甲基化修饰图谱。但亚硫酸氢盐的处理过程繁杂，会降解近半数以上的DNA分子，这会造成DNA序列复杂性严重降低，又会增加目的DNA片段扩增的难度。此外，该处理是将占人类基因组95％的未甲基化C转变为了U，因此对DNA序列的碱基平衡影响极大，会导致后续测序数据质量不高。测序技术中，相较于传统的Sanger测序技术(一代)，以Illumina测序平台为代表的第二代测序技术(NGS)虽然在测序通量和成本上有较大优势，但因其依赖多轮聚合酶链反应(PCR)对DNA分子进行扩增，这不仅带来了部分修饰信息丢失、碱基错配等问题，而且NGS测序片段较短(约50bp～500bp)，这使得测序数据比对和拼接的难度极大。
[0005]近些年来，测序市场新兴的第三代测序技术代表之一的纳米孔测序技术是基于核酸分子通过测序芯片上的纳米孔时产生的电流信号差异来识别序列信息，具有对原始DNA样本文库进行直接测序的特性。因此，该技术在原理上使得其能够在DNA不进行任何预处理的情况下在单碱基分辨率水平上直接识别出碱基序列和碱基修饰，且还具有测序通量高、超长读长、操作简便、耗时较少等优点。此外,基于纳米孔基因测序技术的直接靶向测序技术
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nanopore Cas9Targeted
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Sequencing
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(nCATS，Cas9靶向富集的纳米孔基因测序技术)实现了对单个样本中一个或多个感兴趣基因区域(ROI)的深度测序，这不仅能够矫正测序错误，提高检测度的精确性，并能有效减少其他无关背景基因造成的噪声干扰，减轻了数据分析的难度。但目前该技术并没有开发出用于多个样本中的同一ROI区域的检测方法。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术的目的是提供一种用于直接检测多个样本中BCR
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ABL1融合基因启动子甲基化的试剂盒及使用方法，以至少解决上述相关技术中的不足。
[0007]本专利技术提出一种用于直接检测多个样本中BCR
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ABL1融合基因启动子甲基化的试剂盒，包括：
[0008]源自CRISPR的crRNA探针，所述crRNA探针靶位点位于包含BCR基因启动子在内的CpG岛上游；
[0009]反式激活crRNA，所述反式crRNA序列保守，其5
’
端的序列与crRNA探针3
’
端序列互补配对，可退火为嵌合的单链向导RNA；
[0010]以及，CRISPR相关蛋白Cas9，所述Cas9蛋白具有核酸内切酶活性，与嵌合的单链向导RNA组装成核糖核蛋白复合体RNPs，并在所述嵌合的单链向导RNA的引导下对基因组双链DNA中的所述crRNA靶位点进行切割，使双链DNA断裂；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于直接检测多个样本中BCR
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ABL1融合基因启动子甲基化的试剂盒，其特征在于，包括：源自CRISPR的crRNA探针，所述crRNA探针靶位点位于包含BCR
‑
ABL1融合基因启动子在内的CpG岛上游；反式激活crRNA，所述反式激活crRNA序列保守，其5
’
端的序列与crRNA探针3
’
端序列互补配对，可退火为嵌合的单链向导RNA；以及，CRISPR相关蛋白Cas9，所述Cas 9蛋白具有核酸内切酶活性，与嵌合的单链向导RNA组装成核糖核蛋白复合体RNPs，并在所述嵌合的单链向导RNA的引导下对基因组双链DNA中的所述crRNA靶位点进行切割，使双链DNA断裂；通过以上试剂构成CRISPR/Cas9靶向富集系统。2.根据权利要求1所述的用于直接检测多个样本中BCR
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ABL1融合基因启动子甲基化的试剂盒，其特征在于，所述crRNA探针的5
’
端与靶位点序列互补配对的长度为20个核苷酸，且与所述crRNA探针靶位点相邻的3
’
端序列为PAM基序，所述crRNA探针序列标识号、碱基序列和相应靶位点的PAM基序如下所示：BCR_23177704crRNA：5
’‑
CAAGGGAGAAAGCCACTATC
‑3’
；5
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TGG
‑3’
。3.根据权利要求2所述的用于直接检测多个样本中BCR
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ABL1融合基因启动子甲基化的试剂盒，其特征在于，所述BCR_23177704crRNA探针在每个基因组双链DNA样本中对靶位点的靶向效率通过实时荧光定量聚合酶链反应实验进行质控。4.根据权利要求3所述的用于直接检测多个样本中BCR
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ABL1融合基因启动子甲基化的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量聚合酶链反应实验质控BCR
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23177704crRNA探针的靶向效率所用的引物对为BCR_23177704FP/RP，所述引物对序列如下所示：BCR_23177704FP：5
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CCAACCCAACCCTCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：万绍贵，谢水莲，杨影，李旺，
申请(专利权)人：赣南医学院，
类型：发明
国别省市：