通过合成产生无痕DNA的催化控制测序制造技术

本公开涉及一种方法，该方法包括(a)使聚合酶与模板多核苷酸和多个游离核苷酸接触，其中该模板多核苷酸与互补多核苷酸杂交，该互补多核苷酸包括由该模板多核苷酸的5

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过合成产生无痕DNA的催化控制测序
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年6月30日提交的美国临时专利申请序列号63/045,914的权益，该申请全文据此以引用方式并入。


[0003]本公开整体涉及用于通过合成来产生无痕DNA的催化控制测序的方法。

技术介绍

[0004]许多当前测序平台使用“边合成边测序”(“SBS”)技术和基于荧光的检测方法。期望将允许更具成本效益、更快速和更方便的测序和核酸检测的替代测序方法作为SBS的补充。
[0005]当前SBS技术使用在以下两个位置处修饰的核苷酸：1)脱氧核糖的3
’
羟基(3
’‑
OH)，以及2)含氮碱基(A、T、C、G)的嘧啶的5
‑
位或嘌呤的7
‑
位。3'
‑
OH基团用叠氮甲基封端以产生可逆的核苷酸终止子。这可防止在添加单个核苷酸之后进一步延伸。每个含氮碱基分别用荧光团修饰，以提供识别单碱基掺入的荧光读数。随后，移除3'
‑
OH封端基团和荧光团并重复循环。
[0006]由于修饰脱氧核糖的3'
‑
OH和含氮碱基两者的合成挑战，目前经修饰核苷酸的成本可能很高。存在若干可能的方法来降低经修饰核苷酸的成本。一种方法是将读数标记移动到5
’‑
末端磷酸而不是含氮碱基。在一个示例中，这消除了对单独切割步骤的需要，并允许实时检测进入的核苷酸。在掺入期间，焦磷酸盐与标签一起作为延伸过程的副产物被释放，因此不涉及可切割键。
[0007]在SBS中使用的当前完全官能化的核苷酸(“ffN”)在核碱基上携带染料标记，其可以在每个循环期间在单独的步骤中裂解。在一些情况下，这样的裂解可以化学修饰染料标记附着之处或附近的核苷酸，在DNA上留下“疤痕”，在一些情况下可能不利地影响产生的DNA与SBS聚合酶的结合、下游测序度量或SBS过程的其他方面。
[0008]本公开涉及克服本领域中的这些和其他缺陷。

技术实现思路

[0009]第一方面涉及一种方法。该方法包括(a)使聚合酶与模板多核苷酸和多个游离核苷酸接触，其中模板多核苷酸与互补多核苷酸杂交，该互补多核苷酸包括由模板多核苷酸的5
’
末端片段悬垂的3
’
端，并且多个游离核苷酸包括式(I)的化合物：
[0010][0011]其中R1包括选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的含氮碱基；R2包括
‑
O
‑
R2，其中R2是H或Z，其中Z是包含叠氮基基团的可移除保护基团；R3包括连接基，该连接基包括三个或更多个磷酸基团；并且R4包括荧光标记；其中所述接触在络合条件下发生，该络合条件有效地形成复合物但不会有效地形成聚合，其中该复合物包括聚合酶、模板多核苷酸、互补多核苷酸以及与模板多核苷酸的5
’
末端片段的第一核苷酸互补的多个游离核苷酸中的一个游离核苷酸；(b)检测来自荧光标记的信号；以及(c)将复合物暴露于聚合条件。
[0012]在一个实施方案中，R2由
‑
O
‑
R2组成，其中R2是H或Z，其中Z是包含叠氮基基团的可移除保护基团。在另一个实施方案中，模板多核苷酸是附着到基底的多个模板多核苷酸中的一个模板多核苷酸。在一个实施方案中，附着到基底的多个模板多核苷酸包括文库多核苷酸的拷贝的簇。在另一个实施方案中，该方法还包括重复步骤a)至c)一次或多次。
[0013]在一个实施方案中，聚合条件包括Mg
2+
离子的浓度，其中Mg
2+
离子的浓度在约0.1mM至约10mM的范围内；或Mn
2+
离子的浓度，其中Mn
2+
离子的浓度在约0.1mM至约10mM的范围内。在另一个实施方案中，络合条件包括非催化金属阳离子。在一个实施方案中，非催化金属阳离子选自由Ca
2+
、Zn
2+
、Co
2+
、Ni
2+
、Eu
2+
、Sr
2+
、Ba
2+
、Fe
2+
和Eu
2+
中的一者或多者组成的组。在又一个实施方案中，非催化金属阳离子的浓度小于或等于约10mM。
[0014]在一个实施方案中，络合条件包括螯合剂。在一个实施方案中，螯合剂选自由以下组成的组：乙二醇
‑
双(β
‑
氨基乙基醚)
‑
N,N,N
′
,N
′‑
四乙酸(EGTA)、次氮基乙酸、亚氨基二琥珀酸四钠、乙二醇四乙酸、聚天冬氨酸、乙二胺
‑
N,N'
‑
二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)以及它们的组合。
[0015]在一个实施方案中，络合条件还包括选自由以下组成的组的抑制剂：非竞争性抑制剂、竞争性抑制剂以及它们的组合。在另一个实施方案中，络合条件包括小于约6的pH。
[0016]在另一个实施方案中，聚合条件包括大于或等于约6的pH。在一个实施方案中，络合条件包括非竞争性抑制剂。在一个实施方案中，非竞争性抑制剂选自由以下组成的组：氨基糖苷、焦磷酸盐类似物、黑色素、膦酰基乙酸酯、次磷酸酯、利福霉素以及它们的组合。
[0017]在一个实施方案中，络合条件包括竞争性抑制剂。在一个实施方案中，竞争性抑制剂选自由以下组成的组：阿非迪霉素、β
‑
D
‑
阿拉伯呋喃糖基
‑
CTP、阿米洛利、脱氢阿霉素以及它们的组合。在一个实施方案中，络合条件包括溶剂添加剂。在一个实施方案中，溶剂添加剂选自由以下组成的组：乙醇、甲醇、四氢呋喃、二噁烷、二甲胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、锂、L
‑
半胱氨酸以及它们的组合。在另一个实施方案中，络合条件包括氘。
[0018]在一个实施方案中，3'
‑
羟基封端基团包括可逆终止子。在另一个实施方案中，可逆终止子包括叠氮甲基基团或缩醛基团。在又一个实施方案中，该方法还包括在互补多核
苷酸的3
’
端共价结合到连接基的磷酸基团后移除可逆终止子。在又一个实施方案中，游离核苷酸还包括非桥接硫醇或桥接氮。在一个实施方案中，聚合酶包括突变。在另一个实施方案中，突变改变步骤a)至c)中的一者或多者的速度。
[0019]在SBS中使用的当前ffN在核碱基上携带染料标记，其必须在每个循环期间在单独的步骤中裂解。这种裂解在DNA上留下“疤痕”，从而潜在地影响产生的DNA与SBS聚合酶的结合和下游测序度量。通过将荧光标签(或任何其他检测标签)从核碱基移开到5
’
末端磷酸并小心地控制酶催化，核苷酸的掺入将导致检测标签完全释放，留下无痕DNA，即其核碱基没有有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种方法，所述方法包括：a)使聚合酶与模板多核苷酸和多个游离核苷酸接触，其中所述模板多核苷酸与互补多核苷酸杂交，所述互补多核苷酸包括由所述模板多核苷酸的5
’
末端片段悬垂的3
’
端，并且所述多个游离核苷酸包括式(I)的化合物：其中R1包括选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的含氮碱基；R2由
‑
O
‑
R2组成，其中R2是H或Z，其中Z是包含叠氮基基团的可移除保护基团；R3包括连接基，所述连接基包括三个或更多个磷酸基团；并且R4包括荧光标记；其中所述接触在络合条件下发生，所述络合条件有效地形成复合物但不会有效地形成聚合，其中所述复合物包括所述聚合酶、所述模板多核苷酸、所述互补多核苷酸以及与所述模板多核苷酸的所述5
’
末端片段的第一核苷酸互补的所述多个游离核苷酸中的一个游离核苷酸；b)检测来自荧光标记的信号；以及c)将所述复合物暴露于聚合条件。2.根据权利要求1所述的方法，其中R2由
‑
O
‑
R2组成，其中R2是Z，其中Z是包含叠氮基基团的可移除保护基团。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板多核苷酸是附着到基底的多个模板多核苷酸中的一个模板多核苷酸。4.根据权利要求3所述的方法，其中附着到所述基底的所述多个模板多核苷酸包括文库多核苷酸的拷贝的簇。5.根据权利要求1所述的方法，还包括：重复步骤a)至c)一次或多次。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合条件包括Mg
2+
离子的浓度，其中Mg
2+
离子的所述浓度在约0.1mM至约10mM的范围内；或Mn
2+
离子的浓度，其中Mn
2+
离子的所述浓度在约0.1mM至约10mM的范围内。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述络合条件包括非催化金属阳离子。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述非催化金属阳离子选自由Ca
2+
、Zn
2+
、Co
2+
、Ni
2+
、Eu
2+
、Sr
2+
、Ba
2+
、Fe
2+
和Eu
2+
中的一者或多者组成的组。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述非催化金属阳离子的所述浓度小于或等于约...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：伊鲁米纳公司，
类型：发明
国别省市：