闽楠PbbHLH30基因，其编码的蛋白和应用制造技术

本发明专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及闽楠PbbHLH30基因，其编码的蛋白和应用。该基因的cDNA序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。通过根癌农杆菌介导法转化烟草，获得过表达烟草植株。并对其进行分子检测，对基因过表达的烟草进行花青素提取和PbbHLH30基因的表达分析，结果表明PbbHLH30过表达烟草中花青素含量显著高于对照烟草叶片花青素含量。高于对照烟草叶片花青素含量。

【技术实现步骤摘要】
闽楠PbbHLH30基因，其编码的蛋白和应用


[0001]本专利技术属于植物生物
，涉及闽楠PbbHLH30基因，其编码的蛋白和应用。

技术介绍

[0002]闽楠(Phoebe bournei)属樟科(Lauraceae)楠属植物，是中国的一种本土珍稀阔叶树种，为“金丝楠木”原种植物之一，由于其叶色多样性和直立树干，具有很高观赏价值。闽楠还具有极高的商业价值，其木材因其著名的耐腐性和美丽纹理而被用于制作高贵的建筑、家具和雕塑，其提取物含有多种活性物质，例如花青素和木脂素等。
[0003]有研究表明，花青素不仅为植物提供丰富多样的颜色，还可以减少植物受到昆虫、病原体、紫外线(UV)辐射和非生物胁迫的伤害。还有证据表明，植物中提取的花青素有益于人体健康，作为抗癌剂和抗氧化剂，具有很强的抗氧化、抗癌能力、保护神经、降血脂和降血糖、预防多种慢性疾病并用于治疗相关疾病。
[0004]花青素的抗癌作用已被科研工作者进行广泛研究，花青素通过调节细胞的碳水化合物、脂质和蛋白质代谢及炎症、氧化应激和凋亡信号通路等起到抗癌作用。例如，葡萄中花青素通过抑制IκB
ɑ
磷酸化而阻止肿瘤坏死因子
ɑ
诱导NF
‑
κB被激活，以计量依赖的方式抵抗人结肠癌细胞的侵袭。花青素可以清除活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，如超氧阴离子(O2‑
)、过氧化物自由基(RCOO)、过氧化氢、羟基自由基(OH)和过氧亚硝酸阴离子(ONOO
‑
)等。例如从越橘中分离得到的花青素具有很强的清除超氧阴离子和过氧亚硝酸阴离子的能力。患有代谢综合症的人每天摄入320mg花青素能够显著抑制人体中NF
‑
κB通路相关促炎症因子基因的表达和增强PPAR
‑
γ基因表达降低患炎症风险。树莓中提取的矢车菊素
‑3‑
O
‑
葡萄糖苷可以抑制脂多糖诱导小鼠骨髓巨噬细胞的促炎症因子IL
‑
6、TNF
‑
α、IL
‑
1B、MCP
‑
1和Inos的产生。还有研究表明，摄取花青素能保护中枢神经系统，花青素能够跨过血脑屏障到达脑部多个功能区，降低大脑功能紊乱风险，预防脑缺血和阿尔兹海默症、帕金森等神经退行疾病。花青素提取物还可以降低血清和尿液中的糖含量，并且能够防止氧自由基的产生和降低脂质氧化。
[0005]花青素是常见的黄酮类化合物，而花青素生物合成调控的核心转录因子之一是bHLH蛋白，可通过激活花青素生物合成通路中酶基因的表达。例如，黑果枸杞中一个bHLH基因高表达，可能通过上调类黄酮
‑
花青素生物合成途径，导致黑果枸杞中花青素积累。此外，WD40与MYB和bHLH相互作用，以增强杨梅中花青素积累。在拟南芥中，bHLH113过表达植物的花青素含量显著高于野生型，在开花时茎和分支中尤为明显。我们前期在闽楠红色叶片中发现了丰富花青素，可能与高表达的PbbHLH30基因有关，我们首次在烟草中过表达PbbHLH30基因，验证其在花青素积累中的生物学功能，为人为调控花青素含量提供基因资源。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术提供了闽楠PbbHLH30基因，其编码的蛋白和应用。
[0007]首先，本专利技术提供闽楠PbbHLH30蛋白，其为：
[0008]1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或
[0009]2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
[0010]本专利技术还提供编码所述的闽楠PbbHLH30蛋白的基因。
[0011]优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。
[0012]本专利技术还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。
[0013]本专利技术还提供所述基因在提高植物积累花青素含量中的用途。
[0014]在本专利技术一个具体实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，提高植物积累花青素。
[0015]本专利技术还提供一种提高植物积累花青素的方法，采用农杆菌介导的方法，将含有所述基因的载体转化到植物基因组中，获得转基因植株。其中，所述的转基因植株过表达所述基因。所述的转基因烟草叶片与对照叶片相比，积累更高含量的花青素。
[0016]本专利技术克隆了闽楠PbbHLH30基因，并通过根癌农杆菌介导法转化烟草，获得基因过表达的烟草，并对其进行分子检测，对过表达烟草进行PbbHLH30的表达分析，结果表明PbbHLH30在转基因烟草中显著高表达。进一步提取对照烟草和过表达烟草的花青素，应用紫外可见分光光度计检测花青素绝对含量。结果显示，过表达(OE)烟草中检测到花青素含量显著高于野生型(WT)和空载(EV)烟草中花青素含量，含量分别为0.156ng/g，0.031ng/g和0.029ng/g；总之，我们首次在烟草中过表达闽楠PbbHLH30基因，获得了较高浓度的花青素，即人为调控植物体内花青素合成是可行的，具有较大的运用前景和经济效益。
附图说明
[0017]图1为本专利技术的闽楠叶的总RNA。
[0018]图2为PCR扩增闽楠PbbHLH30基因。
[0019]图3为闽楠PbbHLH30基因的过表达植株中PCR检测。
[0020]图4为鉴定阳性株系中PbbHLH30表达水平分析(荧光定量PCR)。
[0021]图5为PbbHLH30的过表达烟草中叶片的花青素含量分析。
具体实施方式
[0022]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0023]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0025]1 材料
[0026]1.1 实验材料
[0027]闽楠材料取自浙江省丽水市庆元县实验林场。
[0028]烟草使用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)野生型，培养于浙江农林大学智能实验楼生长室，生长条件为25℃光照16h/d。
[0029]1.2实验试剂与仪器
[0030]高保真DNA聚合酶、各种限制性内切酶、Marker、DNA胶回收试剂盒均购自Takara宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒及大肠杆菌感受态购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)股份有限公司；PCR仪为美国PE9700 PCR仪；超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。
[0031]1.3引物合成及测序
[0032]引物合成及测序均由浙江有康生物科技有限公司完成。
[0033]2方法<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.闽楠PbbHLH30蛋白，其为：1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述的闽楠PbbHLH30蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。4.含有权利要求2或3所述基因的载体。5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。6.含...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊红，王立，张毓婷，童再康，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：