基于破骨细胞前体细胞靶向circBBS9敲降的骨质疏松治疗递送系统技术方案

本发明专利技术公开了一种基于破骨细胞前体细胞靶向circBBS9敲降的骨质疏松治疗递送系统，本发明专利技术通过在破骨细胞前体细胞利用siRNA抑制circRNA实现了破骨细胞多核化和骨吸收能力的削弱并保留破骨细胞前体细胞相关功能。同时利用破骨细胞前体细胞同源的细胞膜微囊泡对上述siRNA进行破骨细胞前体细胞靶向性递送，达到了治疗骨质疏松的效果，并提供了其制备方法和应用，其解决了现有治疗方式无法选择性抑制破骨细胞谱系中特定细胞阶段的技术难点。破骨细胞谱系中特定细胞阶段的技术难点。破骨细胞谱系中特定细胞阶段的技术难点。

【技术实现步骤摘要】
基于破骨细胞前体细胞靶向circBBS9敲降的骨质疏松治疗递送系统


[0001]本专利技术属于生物材料及其应用，具体涉及一种基于破骨细胞前体细胞靶向circRNA敲降的骨质疏松治疗递送系统。

技术介绍

[0002]骨质疏松症是临床常见慢性骨骼疾病，其低骨量和严重的骨微组织结构破坏特点，往往会增加骨骼的脆性和易断裂性。作为独特的骨吸收细胞，成熟的多核破骨细胞由于其高转录活性，分泌大量酶和酸发挥骨吸收的功能。然而，破骨细胞的过度多核化会导致骨稳态失衡，从而是引起骨质疏松症的主要因素。目前，对溶骨性疾病的一线治疗，如双膦酸盐，其不加选择地抑制破骨细胞谱系，导致所有骨吸收细胞凋亡，从而破坏必要的骨转换。因此，亟需开发一种治疗体系来选择性靶向破骨细胞谱系中疾病相关特定阶段的破骨细胞前体细胞。
[0003]环状RNA(circRNA)是一种共价闭环结构，它能够被pre
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mRNA反向剪接，在细胞发育和分化过程中表达。鉴于circRNA对RNase R具有抗性，它们在细胞和外泌体中比相应的线性转录本更稳定。circRNA可以在miRNA介导的RNA干扰(RNAi)中成为有效的内源性调节因子。因此，调控circRNA可以有效干预细胞的分化过程。然而，靶向递送针对circRNA的核酸药物开发成为一种难题。
[0004]细胞膜工程化技术已广泛应用于药物输送、成像到光活化治疗等各种领域。用细胞膜伪装的仿生纳米粒子赋予了类似细胞的功能，从而延长了纳米颗粒在血液中的循环，使它们能够逃脱免疫系统的清除。此外，由于它们从细胞中继承了必要的融合蛋白和粘附分子，癌细胞膜包被的纳米颗粒可以特异性地靶向同源细胞。因此，这些细胞膜材料的同型靶向递送是未来疾病治疗的可用策略。
[0005]然而，尽管细胞膜工程化技术已用于各个领域，但尚未实现在细胞多核化过程中具有特定阶段细胞的选择性靶向递送。破骨细胞前体细胞源自RANKL诱导3天的巨噬细胞，具有参与破骨细胞循环、募集、细胞间识别和融合的特定蛋白质。因此，具有特定阶段标记的融合细胞膜有助于破骨细胞前体细胞的选择性靶向递送的作用。
[0006]因此，基于上述背景，本专利发现破骨细胞特异性表达的circRNA及其人类同源物，在破骨细胞多核化和骨质疏松过程中表达突出。其中，circBBS9被挑选出作为验证对象。然而如何在体内实现特定时间精准靶向递送circRNA是限制琪应用的瓶颈问题。为了解决这一关机问题，我们创新性的率先使用破骨前体细胞膜材料搭载siRNA，破骨细胞前体细胞膜微囊泡能够靶向破骨细胞前体细胞。其中，搭载siRNA
circBBS9
的破骨细胞前体细胞膜微囊泡有效抑制破骨细胞的多核化和骨吸收能力而不影响前体破骨细胞的分化，并在体内实验中增加骨质疏松小鼠的骨密度。
[0007]综上，搭载siRNA
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circRNA的破骨细胞前体细胞膜微囊泡可用于临床上骨质疏松的核酸药物研究。

技术实现思路

[0008]本专利技术是为了解决现有递送系统不具有高效、特异靶向破骨细胞谱系中特定阶段细胞的技术问题，提供一种基于破骨细胞前体细胞靶向circBBS9敲降的骨质疏松治疗递送系统。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0010]基于破骨细胞前体细胞靶向circBBS9敲降的骨质疏松治疗递送系统，包括siRNA和靶向破骨细胞前体细胞的细胞膜微囊泡；利用靶向破骨细胞前体细胞的细胞膜微囊泡对siRNA进行破骨细胞前体细胞靶向性递送；
[0011]所述的siRNA为circBBS9的特异性siRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述circBBS9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0012]所述的一种靶向破骨细胞前体细胞的细胞膜微囊泡的制备方法，具体如下：
[0013](1)提取哺乳动物单核细胞，15～30ng/mL M
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CSF诱导3
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5天得到巨噬细胞，再用30～80ng/mL RANKL诱导3
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5天，获得破骨前体细胞；
[0014](2)洗涤，所述的胰酶消化后，具体为胰酶消化3～5min后，终止消化并1000rpm，5min离心，用4℃的TM缓冲液重悬，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4；重悬后利用微型注射器挤出30～40次以破坏细胞，得到细胞匀浆；
[0015](3)加入1M蔗糖与细胞匀浆混合，达到0.25M蔗糖终浓度；
[0016](4)将所述步骤(3)中得到的混合物4℃、2000xg条件下离心10min，收集上清液，4℃、3000xg条件下离心30～35min，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30～35min，得到细胞膜；
[0017](5)将得到的细胞膜用挤出器依次挤过400nm及200nm聚碳酸酯滤膜5～10次，获得可靶向破骨前体细胞的细胞膜纳米囊泡。
[0018]作为优选，所述的哺乳动物单核细胞为6～8周C57BL/6J小鼠胫骨及股骨单核细胞。
[0019]作为优选，所述的微型注射器为1ml胰岛素注射器。
[0020]作为优选，所述的M
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CSF浓度为25ng/mL。
[0021]作为优选，RANKL浓度为50ng/mL。
[0022]作为优选，所述的circBBS9作为骨质疏松干预靶点，miR
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423
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3p为其下游靶点。
[0023]作为优选，所述的siRNA的表达载体为仿生骨靶向纳米颗粒。
[0024]本专利技术的有益效果：
[0025]本专利技术的破骨细胞前体细胞膜微囊泡材料相比现有骨质疏松药物治疗，本专利技术显著的进步在于：
[0026]1)circRNA具有较好的稳定性，在破骨细胞前体细胞多核化过程中高度表达，干预其可抑制破骨细胞多核化和骨吸收能力而保留破骨细胞前体细胞的分化。
[0027]2)以破骨细胞前体细胞为原材料，提取的破骨细胞前体细胞膜微囊泡具有稳定性好，生物相容性好和免疫原性低的特点，为靶向破骨细胞前体细胞提供了一种有效手段。
[0028]3)破骨细胞前体细胞膜微囊泡材料具有明显的体内外破骨细胞前体细胞靶向作用，结合circRNA的特异性表达模式解决了传统药物无选择性破坏破骨细胞谱系问题，从而具有成为骨质疏松治疗的一种高效靶向纳米递送系统前景。
附图说明：
[0029]图1是circBBS9在破骨细胞多核化中的差异表达。
[0030]图2是circBBS9人类同源物在骨质疏松患者和正常人腰椎骨的表达量。
[0031]图3是circBBS9在Rnase R消化后的表达量图
[0032]图4是siRNA
circBBS9
对circBBS9的敲降效果。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于破骨细胞前体细胞靶向circBBS9敲降的骨质疏松治疗递送系统，其特征在于：包括siRNA和靶向破骨细胞前体细胞的细胞膜微囊泡；利用靶向破骨细胞前体细胞的细胞膜微囊泡对siRNA进行破骨细胞前体细胞靶向性递送；所述的siRNA为circBBS9的特异性siRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述circBBS9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的一种靶向破骨细胞前体细胞的细胞膜微囊泡的制备方法，具体如下：(1)提取哺乳动物单核细胞，15～30ng/mL M
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CSF诱导3
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5天得到巨噬细胞，再用30～80ng/mL RANKL诱导3
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5天，获得破骨前体细胞；(2)洗涤，所述的胰酶消化后，具体为胰酶消化3～5min后，终止消化并1000rpm，5min离心，用4℃的TM缓冲液重悬，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4；重悬后利用微型注射器挤出30～40次以破坏细胞，得到细胞匀浆；(3)加入1M蔗糖与细胞匀浆混合，达到0.25M蔗糖终浓度；(4)将所述步骤(3)中得到的混合物4℃、2000xg条件下离心10min，收集上清液，4℃、3000xg条件下离心30～35min，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次...

【专利技术属性】
技术研发人员：林贤丰，王清清，王皓立，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属邵逸夫医院，
类型：发明
国别省市：