一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法。所述试剂盒包括用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crRNA，序列如SEQ ID NO.1～3所示；或者用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crDNA，序列如SEQ ID NO.4～6所示。本发明专利技术提供的用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒可以同时区分待测样品是牛种布鲁氏杆菌菌株、羊种布鲁氏杆菌菌株和猪种布鲁氏杆菌菌株，有效解决了现有技术中布鲁氏杆菌菌株生物种分别鉴定区分的问题，为后续布鲁氏菌病的治疗提供了明确的指导。且操作步骤简单，通过荧光颜色即可肉眼分辨出布鲁氏杆菌菌株生物种，判断布鲁氏菌病的感染来源，为布鲁氏菌病的净化提供全新的思路和方法。新的思路和方法。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法


[0001]本专利技术涉及一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法，属于生物检测


技术介绍

[0002]布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏杆菌(Brucella)感染引起的疾病，是一种人畜共患性全身传染病，简称"布病"，又有地中海弛张热、马耳他热、波浪热等称谓。布鲁氏杆菌可通过皮肤黏膜、呼吸道、消化道等途径侵入机体，引起发热、流产、不育、虚弱、关节痛等临床症状。布鲁氏杆菌宿主广泛、传染性强，不同种布鲁氏杆菌具有宿主间交叉感染的能力，对畜牧业和人类健康均构成严重威胁。因此，在当前严峻的防控形势下研发简便、快速、精确的布鲁氏杆菌检测技术就显得非常迫切。
[0003]布鲁氏杆菌(Brucella)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，无荚膜(光滑型有微荚膜)，触酶、氧化酶阳性，绝对嗜氧菌，可还原硝酸盐，细胞内寄生，可以在很多种家畜体内存活。目前，布鲁氏杆菌属主要有7个种，分别为羊种布鲁氏杆菌(B.melitensis)、牛种布鲁氏杆菌(B.abortus)、猪种布鲁氏杆菌(B.suis)、犬种布鲁氏杆菌(B.canis)、绵羊附睾种布鲁氏杆菌、沙林鼠种布鲁氏杆菌和海洋哺乳动物种布鲁氏杆菌，一共21个生物型。人布鲁氏菌病亦呈上升趋势，人布鲁氏菌病疫情表现出明显的职业性、地区性、季节性，人布鲁氏菌病可能与接触感染动物有关。因此，必须从根本上预防和控制动物布鲁氏菌病。
[0004]一方面，传统的病原分离培养、血清学检测技术和分子生物学检测方法存在诸多局限性，如常规生化识别过程繁琐、周期长、效率低；免疫检测特异性不强，容易造成漏检；RT
‑
PCR需要耗时、繁琐、仪器昂贵不便携带和需要专业人员操作等。另一方面，现有的布鲁氏杆菌的试剂盒虽然能够实现布鲁氏杆菌的检测，但是无法对布鲁氏杆菌的种类进行区分和鉴别。因此，亟需研发一种同时具备检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法。
[0006]本专利技术技术方案如下：
[0007]一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crRNA，所述crRNA为crRNA
‑
Me、crRNA
‑
Ab和crRNA
‑
Su的组合；
[0008]所述crRNA
‑
Me的序列如SEQ ID NO.1所示；所述crRNA
‑
Ab的序列如SEQ ID NO.2所示；所述crRNA
‑
Su的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crDNA，所述crDNA为crDNA
‑
Me、crDNA
‑
Ab和crDNA
‑
Su的组合；
[0010]所述crDNA
‑
Me的序列如SEQ ID NO.4所示；所述crDNA
‑
Ab的序列如SEQ ID NO.5所示；所述crDNA
‑
Su的序列如SEQ ID NO.6所示。
[0011]一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的DNA，所述DNA为DNA
‑
Me、DNA
‑
Ab和DNA
‑
Su的组合；
[0012]所述DNA
‑
Me的序列如SEQ ID NO.7所示；所述DNA
‑
Ab的序列如SEQ ID NO.8所示；所述DNA
‑
Su的序列如SEQ ID NO.9所示。
[0013]所述crDNA
‑
Me、crDNA
‑
Ab和crDNA
‑
Su可以经人工合成得到。所述crRNA
‑
Me、crRNA
‑
Ab和crRNA
‑
Su可以经人工合成得到，或以crDNA
‑
Me、crDNA
‑
Ab和crDNA
‑
Su为模板转录得到。所述DNA
‑
Me是crRNA
‑
Me的靶向序列，用于检测和鉴别羊种布鲁氏杆菌；所述DNA
‑
Ab是crRNA
‑
Ab的靶向序列，用于检测和鉴别牛种布鲁氏杆菌；所述DNA
‑
Su是crRNA
‑
Su的靶向序列，用于检测和鉴别猪种布鲁氏杆菌。
[0014]一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒，包含上述crRNA或crDNA。
[0015]根据本专利技术优选的，所述试剂盒还包括Cas蛋白和荧光探针；
[0016]进一步优选的，所述Cas蛋白为CRISPR
‑
Cas13蛋白；
[0017]根据本专利技术优选的，所述荧光探针序列的5端标记有荧光基团，3端标记有淬灭基团。
[0018]进一步优选的，所述荧光基团为FAM；淬灭基团为BHQ1。
[0019]进一步优选的，所述荧光探针为ssRNA荧光探针，序列为5
’‑
FAM
‑
UUUUU
‑3’
BHQ1。
[0020]一种利用上述试剂盒以非诊断目的检测和鉴别布鲁氏杆菌的方法，包括步骤如下：
[0021](1)提取待测样本的基因组；
[0022](2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和聚合酶的反应体系中，进行RPA扩增；
[0023](3)取RPA扩增产物分别建立Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系，在37℃下，孵育5～30min；
[0024](4)将Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系分别放入LED照射灯下，当Me检测体系荧光显色时，表明待测样本是羊种布鲁氏杆菌菌株；当Ab检测体系荧光显色时，表明待测样本是牛种布鲁氏杆菌菌株；当Su检测体系荧光显色时，表明待测样本是猪种布鲁氏杆菌菌株；当三个反应体系同时不形成荧光显示时，表明待测样本不存在牛、羊和猪种布鲁氏杆菌感染。
[0025]根据本专利技术优选的，步骤(1)中，所述待测样本为经过65～80℃、10分钟预灭活处理的羊、牛和猪的全血、尿液或唾液。
[0026]根据本专利技术优选的，步骤(2)中，所述RPA扩增的引物序列为：
[0027]正向引物：
[0028]5'
‑
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCGTATGGTTCAGCCGCACAATTTCGGAA T
‑
3'；
[0029]反向引物：5'
‑
AACCGGTCATCTGGCAGGGGCAGGCCTTGG
‑
3'。
[0030]根据本专利技术优选的，步骤(2)中，所述RPA扩增体系为：RPA基础反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crRNA，其特征在于，所述crRNA为crRNA
‑
Me、crRNA
‑
Ab和crRNA
‑
Su的组合；所述crRNA
‑
Me的序列如SEQ ID NO.1所示；所述crRNA
‑
Ab的序列如SEQ ID NO.2所示；所述crRNA
‑
Su的序列如SEQ ID NO.3所示。2.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crDNA，其特征在于，所述crDNA为crDNA
‑
Me、crDNA
‑
Ab和crDNA
‑
Su的组合；所述crDNA
‑
Me的序列如SEQ ID NO.4所示；所述crDNA
‑
Ab的序列如SEQ ID NO.5所示；所述crDNA
‑
Su的序列如SEQ ID NO.6所示。3.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的DNA，其特征在于，所述DNA为DNA
‑
Me、DNA
‑
Ab和DNA
‑
Su的组合；所述DNA
‑
Me的序列如SEQ ID NO.7所示；所述DNA
‑
Ab的序列如SEQ ID NO.8所示；所述DNA
‑
Su的序列如SEQ ID NO.9所示。4.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA或权利要求2所述的crDNA。5.如权利要求4所述的用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas蛋白和荧光探针；所述Cas蛋白为CRISPR
‑
Cas13蛋白。6.如权利要求5所述的用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针序列的5端标记有荧光基团，3端标记有淬灭基团；所述荧光基团为FAM；淬灭基团为BHQ1；进一步优选的，所述荧光探针为ssRNA荧光探针，序列为5
’‑
FAM
‑
UUUUU
‑3’
BHQ1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王国俊，李学洋，韩琪，李怀珠，柯欣，张乾义，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：