一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合及其LAMP检测方法技术

本发明专利技术提供了一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合及其LAMP检测方法，涉及分子诊断的快速检测技术领域。针对牛链球菌和牛球虫双病原的核酸基因的双靶点同时检测的引物组合，包括牛链球菌RecN基因引物组合和牛球虫18srRNA基因引物组合；所述牛链球菌RecN基因引物组合为组合I，如序列表SeqIDNO.1～6所示；所述牛球虫18srRNA基因引物组合为引物组合II，如序列表SeqIDNO.31～36所示；所述牛链球菌RecN基因引物组合和牛球虫18srRNA基因引物组合具有灵敏度强、特异性高的特点，实现了牛链球菌和牛球虫两个牛病原体的同时检测；所述检测反应在60℃

【技术实现步骤摘要】
一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合及其LAMP检测方法


[0001]本专利技术涉及分子诊断的快速检测
，具体涉及一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合及其LAMP检测方法。

技术介绍

[0002]牛链球菌(Streptococcus bovis)是牦牛瘤胃中常见的一种兼性厌氧菌，为非β
‑
溶血性链球菌，存在于食草动物消化道内，会导致牦牛等反刍动物瘤胃酸中毒、腹泻等胃肠道疾病。牛球虫病是由多种类型的艾尔美球虫(Eimeria)寄生在牛体内引发的一种具有传染性的体内寄生虫病，是全世界牛中最常见的寄生虫病之一，艾美尔球虫主要寄生在牛的直肠和小肠部位，当牛接触到感染艾美耳球虫的食物之后，球虫直接进入到牛肠道卵囊中，然后分裂增殖，具有很强的感染性。在球虫侵染初期，由于寄生虫的数量相对较少，通常不会引发牛群出现典型的临床症状，但随着寄生虫在牛肠道中的进一步繁殖增长并产生大量毒素，会造成牛群的肠道异常蠕动，不能很好地消化饲料中的营养物质，粪便常会随着肠道异常蠕动排出体外，表现出严重的腹泻症状。上述两种病原均是近年来引起牦牛牧区流行且危害较大的牛疫病病原体，但基于诊断方法较为繁琐、基础执行不规范，准确度不高，严重威胁到牦牛的健康状态，为农牧业带来较大的经济损失，阻碍牦牛业的发展。
[0003]目前，牛链球菌的检测主要依靠细菌分离培养和16s rRNA测序技术，但细菌的分离培养复杂耗时、需要在专业实验室内由专业技术人员操作，因此测序技术需要专业的测序公司才能完成，无法实现在畜牧场对感染牛链球菌的牲畜进行快速现场检测。此外，传统的针对牛球虫的检测方法主要包括牛粪便样本中的卵囊进行形态学检查、饱和食盐水漂浮法和麦克马斯特法。然而，这些传统的牛病原寄生虫检测方法不具备特异性，且检测耗时，需要熟练的技术，存在一定的缺陷。由于牛链球菌和牛球虫是牦牛常见的病原体，均导致牦牛腹泻，无法从症状上区分牦牛的具体病因，因此需要开发一种快速、便捷、更具成本效益的方法准确识别牛链球菌和牛球虫两个牛病原体。
[0004]环介导等温扩增(LAMP)技术依赖于靶DNA的6个独立的区域，因此特异性非常高，反应在等温条件下进行，则不需要PCR仪等昂贵设备，仅用水浴锅等能够维持稳定恒温的设备即可完成，检测成本大大降低，应用范围显著扩大，其高灵敏度、高特异性、快速的扩增得到了市场的检验和认可。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，提供一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合及其LAMP检测方法，其中引物组合Ⅰ是根据牛链球菌RecN基因设计，引物组合Ⅱ是根据牛球虫18s rRNA基因设计，引物组合具有很高的灵敏度、特异性；反应在等温条件下进行，不需要PCR仪等昂贵设备，仅用水浴锅等能够维持稳定恒温的设备即可完成，检测成本大大降低，应用范围显著扩大，可以在田间、牧区等进行实时监测。
[0006]本专利技术采用下述的技术方案：
[0007]一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合，包括牛链球菌RecN基因引物组合和牛球虫18s rRNA基因引物组合。
[0008]所述牛链球菌RecN基因引物组合为引物组合I，包括两个外引物RecN 1
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F3和RecN1
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B3、两个内引物RecN 1
‑
FIP和RecN 1
‑
BIP、两个环导引物RecN 1
‑
LoopF和RecN 1
‑
LoopB，序列表Seq ID NO.1～6所示。
[0009]所述牛球虫18s rRNA基因引物组合为引物组合II，包括两个外引物18s rRNA3
‑
F3和18srRNA3
‑
B3、两个内引物18s rRNA3
‑
FIP和18s rRNA3
‑
BIP、两个环导引物18s rRNA3
‑
LoopF和18s rRNA3
‑
LoopB，序列表Seq ID NO.31～36所示。
[0010]进一步的，所述引物组合I和引物组合II的灵敏度分别为1.0
×
102copies/μL和1.0
×
101copies/μL。
[0011]一种非诊断目的牛链球菌和牛球虫双靶点的LAMP检测方法，包括以下步骤：
[0012](1)提取样本总DNA
[0013](2)利用引物组合I和引物组合II进行LAMP扩增反应
[0014](3)结果判断，若引物组合I以所述总DNA为模板扩增成功，则为牛链球菌阳性；若引物组合Ⅱ以所述总DNA为模板扩增成功，则为牛球虫阳性。
[0015]进一步的，所述引物组合I中，引物RecN 1
‑
F3、RecN 1
‑
B3、RecN 1
‑
FIP、RecN 1
‑
BIP、RecN 1
‑
LoopF、RecN 1
‑
LoopB的浓度分别为1.2μmol/L、1.2μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.4μmol/L；所述引物组合II中，引物18s rRNA3
‑
F3、18s rRNA3
‑
B3、18s rRNA3
‑
FIP、18s rRNA3
‑
BIP、18s rRNA3
‑
LoopF、18s rRNA3
‑
LoopB的浓度分别为1.2μmol/L、1.2μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.4μmol/L。
[0016]进一步的，所述LAMP扩增反应条件为60℃
‑
67℃，10
‑
60min。
[0017]进一步的，所述结果判断是通过反应体系中苯酚红试剂的颜色变化得到；反应结束后，若反应体系是橙黄色，则为阳性结果，若反应体系是紫红色，则为阴性结果。
[0018]牛链球菌和牛球虫双靶点的LAMP检测方法在同时检测牛链球菌和牛球虫中的应用如下：
[0019](1)制备用于检测导致牦牛腹泻的牛链球菌和牛球虫的试剂盒；
[0020](2)鉴定导致牦牛腹泻的牛链球菌和牛球虫；
[0021](3)检测待测样本中是否含有导致牦牛腹泻的牛链球菌和牛球虫。
[0022]本专利技术的有益效果是：
[0023]本专利技术针对牛链球菌和牛球虫的特异基因RecN基因和18s rRNA基因设计获得引物组合Ⅰ和引物组合Ⅱ，具有很高的灵敏度和特异性；实现了牛链球菌和牛球虫两个牛病原体的同时检测；检测反应用时短，半小时可出结果；检测结果可视化，通过颜色变化即可判断样品是否存在牛链球菌和牛球虫；检测设备要求低，仅需水浴锅即可实现；专业性要求低，操作简单方便，能广泛应用于牧区、农场等场所牛链球菌和牛球虫的实时监测，具有很好本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合，其特征在于，包括牛链球菌RecN基因引物组合和牛球虫18s rRNA基因引物组合；所述牛链球菌RecN基因引物组合为引物组合I，包括以下6个引物：RecN 1
‑
F3：GGTCGTTCTATTAGCCGTATC；RecN 1
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B3：TCTCGATAGTGTTTTTTGACAG；RecN 1
‑
FIP：ACCGTGAATATCAACCAAGTACTGCGGTCAAATGGTTAATCTGAC；RecN 1
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BIP：TGACCAAGAAGAATTAATGAAGCCCCTGAAAAATGTTCATCCCCAA；RecN 1
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LoopF：CAACCGCACGAAGGGTT；RecN 1
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LoopB：AACATGCACATCCGTATGCT；所述牛球虫18s rRNA基因引物组合为引物组合II，包括以下6个引物：18s rRNA3
‑
F3：ACGCAAGGAAGTTTGAGGC；18s rRNA3
‑
B3：GGGCGGTGTGTACAAAGG；18s rRNA3
‑
FIP：ACCTTCCGGCCAAGGTCAAGA
‑
CCCTTAGATGTTCTGGGCTG；18s rRNA3
‑
BIP：TGAGTGTGCATCGTGATGGGGA
‑
AGCTGCTGACTTACGCCTA；18s rRNA3
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LoopF：TGCATGCATCAGTGTAGCG；18s rRNA3
‑
LoopB：TTAATCTTCAACGAGGAATGCCTAG。2.根据权利要求1所述的一种牛链球菌和牛球虫双靶点的引物组合，其特征在于，所述引物组合I和引物组合II的灵敏度分别为1.0
×
102copies/μL和1.0
×
101copies/μL。3.一种非诊断目的牛链球菌和牛球虫双靶点的LAMP检测方法，其特征在于，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：王保宁，陈昱作，符立法，唐智慧，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：