一种检测肺炎克雷伯菌的CDA引物组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)的CDA引物组、试剂盒及其应用。所述CDA引物组为针对肺炎克雷伯菌的保守区片段扩增的引物组，即KP

【技术实现步骤摘要】
一种检测肺炎克雷伯菌的CDA引物组、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测肺炎克雷伯菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中克雷白氏杆菌(Klebsiella)，属G(
‑
)兼气性厌氧菌。肺炎克雷伯菌在人宿主中有两个主要的定植渠道：上呼吸道和肠道。经统计，肺炎克雷伯菌是引起肺炎的人类呼吸系统的主要病原体。
[0003]现有检测KP的方法，包括基于RT
‑
PCR的针对病毒基因组特异性核酸序列的扩增信号的检测，但RT
‑
PCR方法需要在标准生化分析实验室，使用精密的实时荧光PCR仪，并需要试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的试验区，并不适用于现场快速筛查。此外，免疫检测技术所制成的试纸条具有简便快捷的优势，但该方法误检率高、灵敏度低，难于检测处于潜伏期的KP携带者，可能造成疫情的扩散。因此，快速、灵敏、高特异性核酸标志物现场检测技术的研发，将对由肺炎克雷伯菌感染所导致的疾病提供快速有力的治疗手段。
[0004]基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediated Isothermal Amplification of nucleic acids，CDA)是由中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院开发的新方法(中国专利号：ZL202110473121.8)，可替代日本LAMP核酸扩增方法。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CDA反应在恒温水浴箱内便可完成，对仪器设备的要求较低，且操作简单，非专业人士也可准确地完成，适合于基层医疗机构及地方检验检疫部门。并且，CDA还可以缩短操作时间，提高检测效率，降低样品污染的机率，适用于肺炎克雷伯菌的快速诊断。此外，CDA所用关键成环引物约为30bp，较LAMP(40bp)短，这将节省检测成本。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是，提供一种检测肺炎克雷伯菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。
[0006]本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术通过对表1所述的4对引物组进行筛选，获得对肺炎克雷伯菌检测效果最优的引物组为KP
‑
MF
‑
4/KP
‑
MR
‑
4。
[0008]表1
[0009]序列号引物名称核苷酸序列(5
’‑3’
)SEQ ID NO.1KP
‑
MF
‑
1TCATTCAGAAACACCAGGAAATCGTTGAGGTSEQ ID NO.2KP
‑
MR
‑
1ATGAAGACTGTTTCGCGACGCTGTTTGTTATSEQ ID NO.3KP
‑
MF
‑
2CACCACCGCCGGGCACAGGAAATCGTTGAGGTCSEQ ID NO.4KP
‑
MR
‑
2GGTGTTTCTGAATGGGCATTATTCGCCAGAT
SEQ ID NO.5KP
‑
MF
‑
3AATTCCCCGACTGGGATTGAGGATGGGTCATSEQ ID NO.6KP
‑
MR
‑
3AATTAAAAAACAGGCGGTGGTGTTTCTGAATSEQ ID NO.7KP
‑
MF
‑
4CACCACCGCCGGGCGTTGGGATTGACGGGATSEQ ID NO.8KP
‑
MR
‑
4GGTGTTTCTGAATGTCTTTATGTCGCTGGCG
[0010]本专利技术还提供一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，所述试剂盒包括CDA引物组KP
‑
MF
‑
4/KP
‑
MR
‑
4。
[0011]作为优选实施方案，所述CDA引物组中的引物KP
‑
MF和KP
‑
MR在反应体系中的浓度均为1～2μM。
[0012]作为优选实施方案，所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、CDA反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。
[0013]作为优选实施方案，所述显色剂选自Sybr green I、Eva green、羟基萘酚蓝或铬黑T。
[0014]作为优选实施方案，所述CDA反应缓冲液包括Tris
‑
HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X
‑
100。
[0015]作为优选实施方案，所述试剂盒反应体系的组成为：
[0016]2～50mM Tris
‑
HClpH8.8
[0017]2～20mM KCl
[0018]2～20mM(NH4)2SO4[0019]2～20mM MgSO4[0020]0.1～0.5％TritonX
‑
100
[0021]0.2～1M甜菜碱
[0022]1～1.6mM dNTP
[0023]5～10U Bst DNA聚合酶
[0024]100～150μmol/L显色剂
[0025]1～2μM引物KP
‑
MF
‑4[0026]1～2μM引物KP
‑
MR
‑4[0027]反应溶剂为超纯水。
[0028]本专利技术还提供该试剂盒用于非疾病诊断目的的检测肺炎克雷伯菌的方法，包括以下步骤：
[0029]步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；
[0030]步骤2，将步骤1所得扩增反应液，于60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有肺炎克雷伯菌。
[0031]本专利技术还提供所述的CDA引物组在以非疾病诊断为目的的肺炎克雷伯菌检测中的应用。
[0032]本专利技术还提供上述试剂盒在以非疾病诊断为目的的肺炎克雷伯菌检测中的应用。
[0033]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0034]1.本专利技术提供的CDA引物组针对肺炎克雷伯菌rcsA的基因特异保守区域(GenBank:AY059955.1)，由2条引物组成，为序列内引物对(KP
‑
MF
‑
4/KP
‑
MR
‑
4)。本专利技术提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中是否
含有肺炎克雷伯菌。
[0035]2.由于本专利技术提供的引物组具有极高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非疾病诊断目的的检测肺炎克雷伯菌的CDA引物组，其特征在于：所述引物组为KP
‑
MF
‑
4/KP
‑
MR
‑
4，其中KP
‑
MF
‑
4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，KP
‑
MR
‑
4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。2.一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的CDA引物组。3.如权利要求2所述的一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：所述CDA引物组中的引物KP
‑
MF
‑
4和KP
‑
MR
‑
4在反应体系中的浓度均为1～2μM。4.如权利要求2所述的一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、CDA反应缓冲液、超纯水和显色剂。5.如权利要求4所述的一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：所述显色剂选自Sybr green I、Eva green、羟基萘酚蓝、铬黑T中的一种。6.如权利要求4所述的一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：所述CDA反应缓冲液包括Tris<...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛瑞，蔡挺，
申请(专利权)人：中国科学院大学宁波华美医院，
类型：发明
国别省市：