检测活性可溶性尿激酶受体的方法和检测用试剂盒技术

本发明专利技术涉及检测活性可溶性尿激酶受体的方法和检测用试剂盒，该活性可溶性尿激酶受体亦称为活性可溶性尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(suPAR)。该方法包括如下步骤：使捕获试剂与待测样品接触，形成捕获试剂与活性suPAR的复合物；使所形成的复合物与特异性结合被捕获的活性suPAR的试剂结合，并通过检测特异性结合被捕获的活性suPAR的试剂来检测被捕获的活性suPAR，所述捕获试剂是含有ATF的融合蛋白。本发明专利技术还涉及上述检测方法所用的试剂盒。本发明专利技术方法呈现如说明书所述优良技术效果。方法呈现如说明书所述优良技术效果。

【技术实现步骤摘要】
检测活性可溶性尿激酶受体的方法和检测用试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学检测领域，具体涉及对活性尿激酶受体进行检测的方法，特别是涉及对活性可溶性尿激酶受体进行检测的方法，该活性可溶性尿激酶受体亦称为活性可溶性尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(Active soluble urokinase
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type plasminogen activator receptor，Active soluble uPAR，活性suPAR)。本专利技术还涉及上述检测方法所用的试剂盒。

技术介绍

[0002]CN105954522B(中国专利申请号201610541379.6)公开了一种活性尿激酶受体的检测方法，其全部内容通过引用并入本文。尿激酶受体(urokinase type plasminogen acitivator receptor，尿激酶型纤溶酶原激活剂受体，uPAR)是一种细胞表面受体。该受体由Stoppelli等于1985年发现，1989年Roldan等克隆了其cDNA，1990年Behrendt等用亲和层析法从人淋巴瘤细胞U937的细胞膜抽提液中纯化出该蛋白。在第五次国际白细胞分化抗原会议上，uPAR被命名为分化抗原簇87(cluster of differentiation 87，CD87)。uPAR是一种高度糖基化的表面膜蛋白，广泛表达于免疫细胞表面，例如激活的嗜中性粒细胞、单核细胞、激活的T淋巴细胞、巨噬细胞，以及多种恶性肿瘤细胞表面，但是在绝大多数正常细胞表面表达量较低[A.Estreicher,et al.The Journal of cell biology 111(2)(1990)783
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92；C.Pyke,et al.Histopathology 24(2)(1994)131
‑
8；M.Thuno,et al.Disease markers27(3)(2009)157
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72；F.Blasi,et al.Molecular cell biology 3(12)(2002)932
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43；T.Plesner,et al.Stem cells 15(6)(1997)398
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408]。
[0003]作为一种柔性分子，uPAR可与多种配体或受体相互作用。如玻连蛋白(vitronectin)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase
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type plasminogen activator，uPA)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low density lipoprotein receptor
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relatedprotein 1，LRP1)、整联蛋白(integrin)、G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor，GPCR)等。这些不同的相互作用在人体多种生理及病理过程中发挥着广泛的重要作用，包括纤溶酶原的激活、细胞黏附和迁移、细胞分化、化学增活现象、趋化因子受体调节、免疫应答、炎症反应等。uPAR由三个富含半胱氨酸、大小为81
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87个氨基酸的Ly6/uPAR结构域组成(D1，D2，D3)，分子量约为55kDa。uPAR通过其C端的糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定在细胞膜表面[F.Blasi,et al.Nature reviews.Molecular cell biology 3(12)(2002)932
‑
43；H.W.Smith,et al.Nature reviews.Molecular cell biology 11(1)(2010)23
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36]。
[0004]尿激酶受体存在着多种的形式，包括全长的膜受体、不含穿膜区的可溶性尿激酶受体(soluble uPAR，suPAR)、以及各种的降解片段。全长的uPAR膜受体易受磷脂酰酶C的水解，使uPAR从细胞膜表面脱落，形成不含糖基化磷脂酰肌醇的可溶性尿激酶受体(solubleuPAR，suPAR)。另外uPAR也对多种水解酶敏感，能够被进一步水解成D1和D2
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D3片段[M.Thuno,et al.suPAR:the molecular crystal ball,Disease markers27(3)(2009)
157
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72]。
[0005]已有的晶体结构研究表明，uPAR通过它的三个结构域形成一个碗状结构，而正是这个碗状结构能高效结合它的配体uPA[C.Yuan,M.Huang,Cellular and molecular life sciences:CMLS 64(9)(2007)1033
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7]，将uPA富集在细胞表面，而将纤溶酶原激活为纤溶酶，进而对胞外基质进行降解，在细胞迁移在发挥重要作用。此外，还证明了uPA与uPAR的结合可大大提高uPAR与玻连蛋白的结合[Q.Huai,et al.Nature structural&molecular biology 15(4)(2008)422
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3]，而大量的文献也证明了uPA与uPAR的结合对其与整合素相互作用的重要性[H.W.Smith,et al.Molecular cell biology 11(1)(2010)23
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36；C.Yuan,M.Huang,Cellular and molecular life sciences:CMLS 64(9)(2007)1033
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7]。这些蛋白与其他蛋白如caveolin等在病灶局部黏附、积聚，整合素受体启动细胞内信号，从而将信号从细胞外传入细胞内，激活细胞内蛋白激酶，促进细胞分裂及细胞迁移。这种uPAR被定义为活性suPAR。只有有活性的uPAR可进行信号的传导，而与肿瘤的侵袭和转移密切相关，而其他uPAR片段没有活性。目前尚没有测定活性suPAR的方法。
[0006]由于uPAR含量与疾病密切相关，目前市场上有很多针对uPAR的诊断方法，它们主要是通过双抗体夹心法来进行检测，一般测定的是血液中有活性和非活性的总量suPAR。如丹麦ViroGates公司推出的检测suPAR的酶联免疫吸附(enzyme
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linked immuno sorbentassay，ELISA)试剂盒已通过了欧洲的CE
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IVD(体外诊断试剂)认证，用于指导临床。这种方法是基于总suPAR在血液中的浓度增高预示着病人免疫系统被持续激活[M.Thuno,et al.Disease markers27(3)(2009)157
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72]，总suPAR在血液中的浓度水平也可作为病情进展的评定指标以及用于病人风险状态的临床决策[O.Slot,et al.Annals of the rheumatic diseases 58(8本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测生物样品中的活性可溶性尿激酶型纤溶酶原激活剂受体的方法，包括如下步骤：1)使捕获试剂与待测样品在适合于所述捕获试剂捕获待测样品中活性suPAR的条件下接触，形成捕获试剂与活性suPAR的复合物；2)使所形成的复合物与特异性结合被捕获的活性suPAR的试剂结合，并通过检测所述特异性结合被捕获的活性suPAR的试剂来检测被捕获的活性suPAR，其中：所述捕获试剂是含有ATF的融合蛋白；所述特异性结合被捕获的活性suPAR的试剂是结合于活性suPAR外侧的单克隆抗体。2.根据权利要求1的方法，所述ATF具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。3.根据权利要求1的方法，其中：所述结合于活性suPAR外侧的单克隆抗体是用uPAR
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D2D3(氨基酸88
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283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗suPAR抗体；所述结合于活性suPAR外侧的单克隆抗体是抗体ATN
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658；随所述单克隆抗体还添加甘油磷酸钠，二者添加的质量比为1：50～100例如1：75；所述特异性结合被捕获的活性suPAR的试剂还包括与所述单克隆抗体结合的二抗，该二抗例如是碱性磷酸酶标记的抗鼠IgG；所述ATF的融合蛋白是ATF与另一种蛋白质或多肽或其片段的融合蛋白；所述另一种蛋白质或多肽或其片段可以是血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)，也可以是卵清蛋白(OVA)；含有ATF的融合蛋白是ATF
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HSA融合蛋白；和/或所述ATF的融合蛋白被固定在固体基质上；所述固体基质包括但不限于多孔板(如96孔板)、蛋白质芯片底膜(例如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)、磁珠等。4.根据权利要求1的方法，其包括如下步骤：(1)向多孔板的孔内加入经包被液稀释的ATF
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HSA蛋白溶液进行包被(4℃过夜)，洗涤并干燥；(2)向孔中加入封闭液进行封闭，室温孵育，洗涤并干燥；(3)向一些孔中分别加入一系列浓度的活性suPAR标准品，向另一些孔中加入的样品稀释液作为空白对照，向其它孔中加入待检样品(例如用样品稀释液稀释10倍的稀释液)；室温孵育，洗涤并干燥；(4)向所有孔内加入经样品稀释液稀释的鼠抗人源suPAR的单克隆抗体例如为ATN
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658抗体，室温孵育，洗涤并干燥；(5)向所有孔内加入碱性磷酸酶标记的抗鼠IgG(例如碱性磷酸酶标记二抗(Anti
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mouse IgG,AP
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linked Antibody))，室温孵育，洗涤并干燥；(6)向每孔内加入显色液，接着将多孔板置于酶标仪上于405nm读取吸光度；(7)依据不同浓度活性suPAR标准品的吸光度随时间变化的动力学过程(酶反应速度)与标准品浓度求得回归方程，用该回归方程计算样品中活性suPAR的浓度。5.根据权利要求1的方法，其包括如下步骤：(1)向多孔板的孔内加入100μl经包被液稀释的ATF
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HSA蛋白溶液(100～150μg/ml例如120μg/ml)进行包被，4℃过夜，洗涤并干燥；(2)向孔中加入100μl封闭液进行封闭，室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥；(3)向一些孔中加入不同浓度的活性suPAR标准品100μl，所述不同浓度分布在0.01～2μg/L浓度范围内，例如在0.03～1μg/L浓度范围内例如分别为1μg/L、0.5μg/L、0.25μg/L、0.125μg/L、0.0625μg/L、0.03125μg/L；向另一些孔中加入100μl的
样品稀释液作为空白对照，空白对照中不含有活性suPAR；向其它孔中加入待检样品的用样品稀释液稀释10倍的稀释液；室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥；(4)向所有孔内加入100μl 5～15μg/ml例如12～15μg/ml经样品稀释液稀释的鼠抗活性suPAR的单克隆抗体，室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥(例如，所述单克隆抗体是用uPAR D2D3(氨基酸88
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283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗suPAR抗体，例如为ATN
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658抗体)；或者，向所有孔内加入(a)100μl的5μg/ml经样品稀释液稀释的鼠抗活性suPAR的单克隆抗体和(b)25μl的1.5mg/ml甘油磷酸钠溶液，室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥(例如，所述单克隆抗体是用uPAR D2D3(氨基酸88
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283)免疫小鼠，经杂交瘤技术筛选而得到的单克隆抗suPAR抗体，例如为ATN
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658抗体)；(5)向所有孔内加入100μl经样品稀释液500倍稀释的碱性磷酸酶标记的抗鼠IgG(例如碱性磷酸酶标记二抗(Anti
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mouse IgG,AP
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linked Antibody))，室温80转/分，孵育1小时，洗涤并干燥；(6)向每孔内加入100μl显色液，接着将酶标板置于酶标仪上于405nm读取吸光度，共读取60min，每1min读取一次吸光度值；(7)依据不同浓度活性suPAR标准品的吸光度随时间变化的动力学过程(酶反应速度)与标准品浓度求得回归方程，用该回归方程计算样品中活性suPAR的浓度。6.根据权利要求1的方法，其包括如下步骤：(1)血浆样品的处理：将采集自待检受试者的外周血置于EDTA
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2Na抗凝管中，离心分取血浆，用样品稀释液稀释，分装，待用；(2)包被：向酶标板(即多孔板，96孔)的1A
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12H所有孔内加入100μl经包被液稀释的ATF
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HSA蛋白溶液(120μg/ml)，4℃过夜；用洗涤液洗涤，干燥；(3)封闭：向酶标板内1A
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12H所有孔中加入100μl封闭液，密封，孵育，用洗涤液洗涤，干燥；(4)加样：分别向酶标板1A
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1F加入不同浓度的活性suPAR标准品100μl，向G1、G2分别加入100μl的样品稀释液作为空白对照，向酶标板内其它孔加入待检受试者的稀释血浆样品，密封，室温孵育，用洗涤液洗涤，干燥；...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈曦，黄明东，袁彩，江龙光，陈佳宇，汪泽云，
申请(专利权)人：福建亿彤生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：