准确测量未加工的C末端赖氨酸的重肽方法技术

本公开提供了一种用于准确测量蛋白质，诸如抗体的翻译后修饰的方法。具体地，该方法涉及使用重同位素标准品来生成校准曲线，以允许对经修饰的肽进行准确定量。该方法可用于使用质谱法对抗体中的C末端截短进行准确定量。质谱法对抗体中的C末端截短进行准确定量。质谱法对抗体中的C末端截短进行准确定量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】准确测量未加工的C末端赖氨酸的重肽方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年6月18日提交的美国临时专利申请号63/041,015的优先权和权益，该专利申请通过引用并入本文。


[0003]本申请涉及在液相色谱
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质谱分析中使用重同位素标准品对感兴趣蛋白质中的翻译后修饰(PTM)进行鉴定和定量的方法。

技术介绍

[0004]治疗性单克隆抗体(mAb)和双特异性抗体(bsAb)在治疗许多病症中起着关键作用。这类药物的优点，包含对种类繁多的分子靶标的高特异性和亲和力，保证了它们的持续发展，并导致批准用于治疗健康状况，如哮喘、类风湿性关节炎和低密度脂蛋白胆固醇升高等。虽然治疗性抗体在商业和科学上的成功是前所未有的，但它们的固有益处因其巨大的尺寸、复杂性和化学异质性而受到限制，因此需要使用众多方法来评估它们的安全性和有效性。
[0005]这些方法的很大一部分通常用于评估翻译后修饰(PTM)，这是一种产品质量属性，也是质量和电荷异质性的主要来源。高灵敏度质谱仪检测器与不断增加的液相色谱柱化学和酶处理条件相结合形成了一套成熟的PTM表征方法。基于质谱(MS)的肽图谱测定允许对所有相关的PTM进行鉴定、定位和定量，且在最佳条件下检测限例如小于0.1％。
[0006]通过提取离子色谱图(XIC)进行PTM定量的优势伴随着一些挑战，这些挑战对该方法的准确性和精确性产生影响。这些问题中的许多都与未修饰的肽与修饰形式的肽的电离差异有关。例如，与未加工形式(K，z＝2+)相比，由于电离效率的差异和肽的主要电荷状态减小到1+，C末端K截短(des
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K)值可能特别受影响。未加工的C末端K的相对丰度百分比通常是相对于K和des
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K的和来计算的，但是先前的研究发现，在肽图谱定量期间，K的百分比可能被高估，因为，例如，肽序列C末端上额外的K相对于des
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K肽增加了电离效率。
[0007]一些最小化该误差的尝试包含仅使用最丰富的电荷状态来计算每种肽的XIC曲线下面积(AUC)，或者使用通过将等摩尔量的每种肽注射到LC柱上并测定质谱仪响应来确定的校正因子。然而，虽然第一种方法可以降低未加工的C末端K值的大小，但是此时没有或很少有经验知道该值应该降低多少。校正因子方法假设校正因子在未加工的C末端K的可能浓度范围内，在潜在的共洗脱肽存在下，并且在不同的质谱仪之间保持不变。这些因素的变化将导致加工后的测量值与未加工的C末端K值相比更不准确，这在使用静态校正因子时可能无法补偿。
[0008]因此，需要一种方法对感兴趣蛋白质中PTM的存在进行准确定量，以校正经修饰的肽和未修饰的肽的电离效率的差异。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供了使用重肽方法准确和精确表征蛋白质诸如抗体中PTM的方法。更具体地，本公开提供了对抗体中未加工的C末端赖氨酸(K)进行定量的方法。提供了使用重肽方法对C末端K进行定量的方法。
[0010]在一些示例性实施例中，该方法包括(a)将包含所述感兴趣蛋白质的样品与消化酶接触，以获得肽消化物；(b)向所述肽消化物中加入一组重肽标准品，其中至少一种重肽标准品包含所述翻译后修饰，并且至少一种重肽标准品不包含所述翻译后修饰；(c)使用液相色谱
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质谱法对所述添加了所述重肽标准品的肽消化物进行分析，以获得与所述肽消化物和所述重肽标准品的每种肽对应的信号；(d)使用包含所述翻译后修饰的所述至少一种重肽标准品与不包含所述翻译后修饰的所述至少一种重肽标准品相比的相对信号，生成校准曲线；(e)使用来自包含所述翻译后修饰的所述感兴趣蛋白质的至少一种肽与来自不包含所述翻译后修饰的所述感兴趣蛋白质的至少一种肽相比的相对信号对所述感兴趣蛋白质的翻译后修饰进行定量；和(f)使用(d)的校准曲线校正(e)的结果，以进一步对所述感兴趣蛋白质的所述翻译后修饰进行定量。
[0011]在一个方面，感兴趣蛋白质是治疗性蛋白质。在具体方面，所述治疗性蛋白质选自由抗体、可溶性受体、抗体
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药物缀合物和酶组成的组。
[0012]在一个方面，所述感兴趣蛋白质是单克隆抗体。在另一方面，所述感兴趣蛋白质是双特异性抗体。
[0013]在一个方面，所述翻译后修饰是存在未加工的C末端赖氨酸。
[0014]在一个方面，所述重肽标准品相对于至少一种其他重肽标准品以约1:1至约1:1000的摩尔比存在。在另一方面，所述重肽标准品包括约1至约16种重同位素。在另一方面，所述重肽标准品包括C
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、N
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或其组合。
[0015]在一个方面，所述消化酶是胰蛋白酶。
[0016]在一个方面，所述液相色谱法包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
[0017]在一个方面，所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪(诸如Orbitrap质谱仪)、Q
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TOF质谱仪或三重四极质谱仪，其中所述质谱仪与所述液相色谱系统联用，并且其中所述质谱仪能够进行LC
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MS、LC
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MRM
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MS和/或LC
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MS/MS分析。
[0018]本公开还提供了用于实施本专利技术的方法的试剂盒。在一些示例性实施例中，该试剂盒包括第一组合物，其包含至少一种包含翻译后修饰的重肽标准品；和第二组合物，其包含至少一种不包含所述翻译后修饰的重肽标准品，其中当通过质谱分析时，包含所述翻译后修饰的所述至少一种重肽标准品与不包含所述翻译后修饰的所述至少一种重肽标准品相比的相对信号可用于生成校准曲线，其中所述校准曲线可用于对感兴趣蛋白质的翻译后修饰进行定量。
[0019]在一个方面，所述翻译后修饰是存在未加工的C末端赖氨酸。
[0020]在一个方面，所述重肽标准品相对于至少一种其他重肽标准品以约1:1至约1:1000的摩尔比存在。在另一方面，所述重肽标准品包括约1至约16种重同位素。在另一方面，所述重肽标准品包括C
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、N
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或其组合。
[0021]在一个方面，试剂盒还包括至少一种轻肽标准品。
[0022]在一个方面，试剂盒的组合物可以包装在水性介质中或呈冻干形式。
[0023]在一个方面，组合物可以在容器中提供。该试剂盒的容器装置通常将包含组分可以放置于其中并且优选地是适当等分的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置。在另一方面，试剂盒的组合物可以干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来对粉末进行重构。设想溶剂也可以在另一个容器装置中提供。
[0024]当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本专利技术的这些方面和其他方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对感兴趣蛋白质的翻译后修饰进行定量的方法，其包括：(a)使包含所述感兴趣蛋白质的样品与消化酶接触以获得肽消化物；(b)向所述肽消化物中加入一组重肽标准品，其中至少一种重肽标准品包含所述翻译后修饰，并且至少一种重肽标准品不包含所述翻译后修饰；(c)使用液相色谱
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质谱法对所述添加了所述重肽标准品的肽消化物进行分析，以获得与所述肽消化物和所述重肽标准品的每个肽对应的信号；(d)使用包含所述翻译后修饰的所述至少一种重肽标准品与不包含所述翻译后修饰的所述至少一种重肽标准品相比的相对信号，生成校准曲线；(e)使用来自包含所述翻译后修饰的所述感兴趣蛋白质的至少一种肽与来自不包含所述翻译后修饰的所述感兴趣蛋白质的至少一种肽相比的所述相对信号来对所述感兴趣蛋白质的翻译后修饰进行定量；和(f)使用(d)的所述校准曲线将(e)的结果归一化，以进一步对所述感兴趣蛋白质的所述翻译后修饰进行定量。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣蛋白质是治疗性蛋白质。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述治疗性蛋白质选自由抗体、可溶性受体、抗体
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药物缀合物和酶组成的组。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣蛋白质是单克隆抗体。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣蛋白质是双特异性抗体。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述翻译后修饰是存在未加工的C末端赖氨酸。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述重肽标准品相对于至少一种其他重肽标准品以约1:1至约1:1000的摩尔比存在。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述重肽标准品包括约1至约16种重同位素。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述重肽标准品包括C
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或其组合。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化酶是胰蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：