用于亲和色谱基质的消毒方法技术

本发明专利技术公开了一种用于亲和色谱基质清洗或消毒的方法，包括以下步骤：a）提供一种具有偶联到载体的耐氧化蛋白质类配体的亲和色谱基质，b）使所述基质与含有至少一种由分子式I定义的氧化剂的消毒溶液接触，R

【技术实现步骤摘要】
用于亲和色谱基质的消毒方法


[0001]本专利技术涉及亲和色谱领域，更具体地涉及一种消毒亲和色谱基质的方法。

技术介绍

[0002]免疫球蛋白和免疫球蛋白片段代表在全球制造或开发中的最流行的生物制药产品。这种特定治疗市场的高商业需求以及由此带来的价值，已经导致重点放在制药公司上，使它们各自制造过程的生产力最大化，同时控制相关成本和保持产品质量。
[0003]亲和色谱，一般在含有葡萄球菌蛋白A或其变体的基质上，通常被用作完整免疫球蛋白分子纯化的关键步骤之一。蛋白A对免疫球蛋白Fc链的高度选择性结合提供了具有杂质和污染物的极高清除率的通用步骤。类似地，含有消化链球菌蛋白L或其变体的基质可用于纯化如Fabs或抗体的其它片段，如scFv、BiTEs、结构域抗体等，它们包含κ轻链。
[0004]任何生物过程的色谱应用都需要对杂质和污染物的确定去除进行全面的关注。这些杂质或污染物例如可以是在色谱过程中吸附到固定相或基质的没有被洗脱的分子，例如非期望的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。从基质中去除这些杂质/污染物通常在第一次洗脱所需的产品后进行，以便在后续使用之前使基质再生。这样的去除通常涉及一种被称为原位清洗（CIP）的过程，并且通常涉及碱性溶液。
[0005]此外，需要对基质进行定期的消毒，以使柱子中出现的任何微生物或芽孢失活。这通常作为一种原位消毒(SIP)过程进行，涉及氢氧化钠或酸性溶液，例如含有抑菌剂如苄醇的磷酸/醋酸混合物。然而，在使用具有蛋白质类配体的基质的情况下，很难找到有效杀死微生物和芽孢而不损害配体的条件。
[0006]因此，本领域中仍然需要不损害配体的有效的SIP方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的一方面是提供一种用于具有蛋白质类配体的亲和色谱介质的消毒和/或清洗方法，该方法基本不会损害配体的功能。这通过权利要求1所定义的方法来实现。
[0008]一个优点在于可以实现细菌和芽孢的高度失活。另一优点在于与产品相关的杂质如紧密结合的非洗脱抗体或与过程相关的杂质如宿主细胞蛋白可以被除去。
[0009]本专利技术的第二个方面是提供氧化剂溶液用于亲和色谱介质的消毒和/或清洗的用途。这通过在权利要求中定义的用途来实现。
[0010]本专利技术更多合适的实施方案在从属权利要求中进行了描述。
[0011]定义术语“抗体”和“免疫球蛋白”在此可互换使用，并且理解为也包括抗体片段、含有抗体或抗体片段的融合蛋白以及含有抗体或抗体片段的缀合物。
[0012]术语“κ轻链结合多肽”和“κ轻链结合蛋白”在此分别指能够结合到抗体的κ轻链的多肽或蛋白，包括例如蛋白L以及保持所述结合特性的其任何变体、片段或融合蛋白。
[0013]术语“耐氧化”在此指这样的物质，用0.1 M过氧乙酸水溶液在22+/
‑
2 ℃孵育24小
时后，其功能保留至少80%，例如至少90%。该功能例如可以为对于靶物质例如免疫球蛋白、IgG、单克隆抗体或抗体片段的结合能力。
[0014]术语“亲和色谱基质”在此指具有能够结合靶物质的配体的分离基质，其中平衡解离常数K
D
小于约10
‑
5 M，例如在10
‑
14
到10
‑
6 M之间。在此，K
D
被定义为K
D = [L]*[T]/[LT]，其中[L]为游离配体的浓度，[T]为游离靶物质的浓度，以及[LT]为配体
‑
靶物质复合物的浓度。大多数这样的配体都是蛋白质，例如可以包括细菌的免疫球蛋白结合蛋白质及其变体、抗体、链霉亲和素、凝集素等。所述靶物质例如可以为蛋白质，诸如免疫球蛋白。
附图说明
[0015]图1显示了重组蛋白L在0.1 M过氧乙酸中孵育1 h前（a）和后（b）的色谱图(紫外检测)。x轴表示时间，y轴表示紫外吸光度(280nm)。
[0016]图2显示了针对κ链的单链骆驼抗体（KappaSelect配体）在0.1 M过氧乙酸中孵育1 h前（a）和后（b）的色谱图(紫外检测)。x轴表示时间，y轴表示紫外吸光度(280nm)。
[0017]图3显示了重组蛋白L在0.1 M过氧乙酸中孵育1 h前（a）和后（b）的色谱图(MS检测)。x轴表示时间，y轴表示MS响应。
[0018]图4显示了针对κ链的单链骆驼抗体（KappaSelect配体）在0.1 M过氧乙酸中孵育1 h前（a）和后（b）的色谱图(MS检测)。x轴表示时间，y轴表示MS响应。
[0019]图5显示了刚性琼脂糖基础基质的压力
‑
流量曲线，a)未经处理的基质以及b) 用30mM过氧乙酸溶液孵育后的相同基质样品。
具体实施方式
[0020]在一方面，本专利技术公开了一种用于亲和色谱基质清洗或消毒的方法。该方法包含以下步骤：a) 提供一种具有偶联到载体的耐氧化蛋白质类配体的亲和色谱基质。所述蛋白质类配体可以适当地包括一个或多个来源于细菌蛋白的免疫球蛋白结合域或基本上由其组成。细菌免疫球蛋白结合蛋白在本领域是公知的（参阅例如E V Sidorin, T F Soloveva: Biochemistry Moscow 76(3), 295
‑
308, 2011），并且特别可以以革兰氏阳性细菌的免疫球蛋白结合蛋白为例，例如葡萄球菌蛋白A（SpA, SEQ ID NO:17）、消化链球菌蛋白L（SEQ ID NO:18）和链球菌蛋白G（SEQ ID NO:19）。这些蛋白质具有共同的单链结构，其特征为在分子中存在三个不同区域：N
‑
末端区域，包含负责蛋白质穿过细胞质膜易位然后分离的信号肽；功能区域，包括决定蛋白质功能活性的数个结构域；以及C
‑
末端区域，表示为负责在细胞壁中锚定蛋白质的分选信号。功能区域按照单一原则构建：它们包含一种或几种类型的多肽重复。同一类型的高度同源重复可以被串联组织起来。重复的次数可以改变并决定分子量和功能活性的蛋白质异质性。用作亲和配体的这些蛋白质的重组变体通常缺乏C
‑
末端区域，因为出于此目的是不需要的。它们也可以有不同的N
‑
末端区域和在结构域内选择的点突变，以例如提高蛋白质的碱稳定性。
[0021]b）使所述基质与含有至少一种由分子式I定义的氧化剂的消毒溶液接触，R
ꢀ–ꢀ
O
ꢀ–ꢀ
O
ꢀ–ꢀ
H
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(I)其中，R为氢或酰基R
’‑
C(O)
‑
，R
’
为氢或甲基、乙基或丙基。这类氧化剂包括过氧化
氢H2O2、过氧甲酸HCO3H、过氧乙酸CH3CO3H、过氧丙酸CH3CH2CO3H和过氧丁酸CH3CH2CH2CO3H。消毒溶液的pH例如可以为2
‑
12，例如2
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于亲和色谱基质清洗或消毒的方法，包括以下步骤：a）提供一种具有偶联到载体的耐氧化蛋白质类配体的亲和色谱基质，b）使所述基质与含有至少一种由分子式I定义的氧化剂的消毒溶液接触，R
ꢀ–ꢀ
O
ꢀ–ꢀ
O
ꢀ–ꢀ
H
ꢀꢀ
(I)其中，R为氢或酰基R
’‑
C(O)
‑
，R
’
为氢或甲基、乙基或丙基，其中，所述消毒溶液的pH为2
‑
4，其中，所述蛋白质类配体包括一个或多个来源于细菌蛋白的免疫球蛋白结合域或基本上由其组成，并且其中，所述细菌蛋白选自葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A、消化链球菌(Peptostreptococcus)蛋白L和链球菌(Streptococcus)蛋白G。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述消毒溶液中所述氧化剂的浓度为0.01
‑
1 mol/L。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述消毒溶液的pH为2
‑
3。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述氧化剂选自过氧化氢、过氧甲酸和过氧乙酸。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述消毒溶液含有至少两种由分子式I定义的氧化剂的混合物。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述消毒溶液含有过氧化氢与过氧甲酸或过氧乙酸的混合物。7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，由分子式I定义的氧化剂的总浓度为0.01
‑
1 mol/L。8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤b）中基质用所述消毒溶液孵育1 min
‑
24 h。9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述基质在步骤b）之后对目标蛋白例如免疫球蛋白的结合能力保留至少80%。10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细菌蛋白选自葡萄球菌蛋白A和消化链球菌蛋白L。11.根据权利要求1或2的方法，其中，所述配体包括来源于细菌蛋白的免疫球蛋白结合域的同源或异源多聚体或基本上由其组成。12.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合域与葡萄球菌蛋白A的结构域E、D、A、B或C、与蛋白Z、或与消化链球菌蛋白L的结构域1、2、3、4或5具有至少80%的同源性。13.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合域由选自SEQ ID NO：1
‑
11的氨基酸序列定义，或与该氨基酸序列具有至少80%的序列同源性。14.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合域由选自SEQ ID NO：12
‑
16的氨基酸序列定义，或与该氨基酸序列具有至少90%的序列同源性。15.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述配体包括葡萄球菌蛋白A或葡萄球菌蛋白A的碱稳定的免疫球蛋白结合变体。16.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述配体包括消化链球菌蛋白L或消化链球
菌蛋白L的碱稳定的免疫球蛋白结合变体。17.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述亲和色谱基质选自Capto
TM L、MabSelect
TM
、MabSelect Xtra、ProSep
TM
‑
A、ProSep Ultra Plus、AbSolute
TM
、CaptivA
TM PriMab
TM
和Protein A Diamond或选自MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、Eshmuno
TM A、Toyopearl
TM AF
‑
rProtein A、Amsphere
TM Protein A和Ka...

【专利技术属性】
技术研发人员：EM莫尼伊，T布乔克曼，A格龙伯格，A荣格洛夫，GJ罗德里戈，K托斯坦森，MC维特哈尔，
申请(专利权)人：思拓凡生物工艺研发有限公司，
类型：发明
国别省市：