本发明专利技术公开了一种从香紫苏醇生产菌株发酵液中富集和纯化香紫苏醇的方法。方法包括(1)发酵液离心得到菌体和香紫苏醇混合物；(2)用有机溶剂溶解混合物中香紫苏醇，离心获得上清；(3)上清蒸干后，加入溶剂进行结晶，得到香紫苏醇产品I。该产品香紫苏醇的含量>97％，收率>70％；获得的结晶母液可以利用层析结合结晶手段，得到香紫苏醇产品II，该产品香紫苏醇的含量>95％，收率>65％；综合产品I和II，总收率可达90％以上。本发明专利技术的提取和纯化过程步骤少，收率高，操作简单，所用溶剂可循环利用，对环境友好。环境友好。环境友好。
【技术实现步骤摘要】
从香紫苏醇微生物发酵液中富集和纯化香紫苏醇的方法
[0001]本专利技术公开了一种从发酵液中富集和纯化香紫苏醇的方法。属于生物功能分子提取与纯化领域。
技术介绍
[0002]香紫苏醇(Sclareol)是一种二萜类化合物，结构如下所示是植物生长，发育和一般代谢必不可少的化学物质，可应用于医药，化妆品，保健品，香精香料及农药领域。
[0003]目前较多的报道都是从香紫苏花序中提取分离天然的香紫苏醇。随着合成生物学的不断发展，利用合成生物学的方法生产香紫苏醇的技术不断成熟。但是对于微生物发酵法生产香紫苏醇的下游工作，即从发酵液中富集和纯化香紫苏醇的报道极少。专利(申请号202210267083.5)公开了一种从香紫苏醇发酵液中提取和纯化香紫苏醇的方法，但是，该工艺的分离对象为胞内产生的香紫苏醇，对于绝大多数胞外产香紫苏醇微生物的发酵液，由于发酵液成分的复杂性，其面对的待分离杂质也更加复杂，而目前缺乏相应的富集及纯化技术。
技术实现思路
[0004]本专利技术是针对上述存在的不足，提供一种从发酵液中富集、纯化香紫苏醇的方法。其具体内容为：
[0005]一种从香紫苏醇发酵液中富集和纯化香紫苏醇的方法，主要包括以下步骤：
[0006](1)将发酵液以3000rpm
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15000rpm的转速离心5
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30min，除去上清液，收集下层沉淀；
[0007](2)向沉淀中加入醇溶剂，在35
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40摄氏度下搅拌2
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4h用于香紫苏醇的提取，提取液离心固液分离后，沉淀再次用溶剂提取离心，反复提取离心，共提取离心3
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5次，合并离心上清液，浓缩至干，得到提取物；
[0008](3)向提取物中加入溶剂，50
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60摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液结晶，固液分离，得到结晶母液和纯化的香紫苏醇产品I；
[0009](4)获得的结晶母液直接过硅胶层析柱，并依次用正己烷和乙酸乙酯进行洗脱，正己烷(体积ml)：硅胶(质量g)＝5～8:1，乙酸乙酯(体积ml)：硅胶(质量g)＝5～8:1，收集含香紫苏醇的组分，浓缩至干；
[0010](5)干燥后含香紫苏醇组分的样品加入溶剂，50
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60摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液结晶，得到纯化的香紫苏醇产品II。
[0011]其中，步骤(1)的沉淀中主要含有菌体以及包括香紫苏醇在内的发酵液和代谢产物中非水溶性化合物，通过离心手段，可以快速将香紫苏醇进行富集；步骤(2)的目的是利
NaOH溶液控制发酵罐培养基p H在5.0左右，通过调整搅拌转数控制溶解氧大于20％。发酵液中葡萄糖及生成的乙醇消耗完后开始用800g/L葡萄糖水溶液补料，使葡萄糖终浓度达到20g/L。当OD600达到50左右，采用补料
‑
溶氧联动方式补料，当溶氧高于30％时，开始补料，达到35％时，停止补料，补料溶液为800g/L葡萄糖水溶液。培养196h后卸罐，搅匀后取样检测发酵液中香紫苏醇含量为820
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1200mg/L。
[0022]其中摇瓶培养基成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，水为溶剂；
[0023]发酵罐培养基成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾3g/L，水为溶剂。
[0024]实施例2
[0025]步骤1)取30L实施例1的发酵液，5000rpm离心15分钟，除去上清液，获得3000mL下层沉淀。
[0026]步骤2)沉淀用体积分数95％乙醇提取4次，每次用量3000mL，每次加入95％乙醇在35摄氏度下搅拌4h，然后离心固液分离；合并4次提取液，浓缩至干，得到44.4g提取物(香紫苏醇质量含量55.4％)。
[0027]步骤3)向提取物中加入66.6ml正己烷，55摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液在20摄氏度下放置进行结晶，20h后，过滤晶体并用约30mL
‑
10摄氏度冷正己烷洗涤，晶体经干燥后，得到纯化的香紫苏醇产品I18.3g(白色针状晶体)，经高效液相色谱分析，质量纯度为97.1％，单步质量收率达到72.2％。同时合并滤液及洗液，得到80ml结晶母液。
[0028]步骤4)将上述结晶母液(固体质量25.0g，含香紫苏醇6.84g)进行过柱分离。柱子为玻璃柱，装有200目硅胶75g，进样完毕后，先用375ml正己烷洗脱非极性杂质，再用375ml乙酸乙酯洗脱香紫苏醇，合并含香紫苏醇的组分，并浓缩至干，获得8.4g固体。
[0029]步骤5)向固体中加入12.6mL正己烷55摄氏度加热溶解，滤液在12摄氏度下放置进行结晶，12h后，过滤晶体并干燥，得到纯化的香紫苏醇产品II 4.74g(白色针状晶体)，经液相色谱分析，质量纯度为95.8％，单步质量收率达到66.4％。综合产品I和II，总收率达到90.7％。
[0030]实施例3
[0031]步骤1)取30L实施例1的发酵液，3000rpm离心30分钟，除去上清液，获得3000mL下层沉淀。
[0032]步骤2)沉淀用体积分数50％乙醇提取5次，每次用量13.5L，每次加入50％乙醇在40摄氏度下搅拌2h，然后离心固液分离；合并5次提取液，浓缩至干，得到51.4g提取物(香紫苏醇质量含量46.7％)。
[0033]步骤3)向提取物中加入257ml石油醚，50摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液在
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5摄氏度下放置进行结晶，1h后，过滤晶体并用约30mL
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10摄氏度冷石油醚洗涤，晶体经干燥后，得到纯化的香紫苏醇产品I17.4g(白色针状晶体)，经高效液相色谱分析，质量纯度为97.0％，单步质量收率达到70.0％。同时合并滤液及洗液，得到260mL结晶母液。
[0034]步骤4)将上述结晶母液(固体质量33.2g，含香紫苏醇7.21g)进行过柱分离。柱子为玻璃柱，装有200目硅胶332g，进样完毕后，先用2656ml正己烷洗脱非极性杂质，再用2656ml乙酸乙酯洗脱香紫苏醇，合并含香紫苏醇的组分，并浓缩至干，获得8.1g固体。
[0035]步骤5)向固体中加入40.5ml石油醚50摄氏度加热溶解，滤液在20摄氏度下放置进
行结晶，20h后，过滤晶体并干燥，得到纯化的香紫苏醇产品II 4.85g(白色针状晶体)，经液相色谱分析，质量纯度为97.2％，单步质量收率达到65.4％。综合产品I和II，总收率达到90.0％。
[0036]实施例4
[0037]步骤1)取30L实施例1的发酵液，15000rpm离心5分钟，除去上清液，获得2500ml下层沉淀。
[0038]步骤2)沉淀用体积分数90％的乙醇提取3次，每次用量10L，每次加入90％乙醇在38摄氏度下搅拌3h，然后离心固液分离；合并3次提取液，浓缩至干，得到46.5本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.从香紫苏醇微生物发酵液中富集和纯化香紫苏醇的方法，其特征在于，操作流程主要步骤包括：1)将香紫苏醇的微生物发酵液以3000rpm
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15000rpm的转速离心5
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30min，除去上清液，收集下层沉淀；2)向沉淀中加入醇溶剂，在35
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40摄氏度下搅拌2
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4h用于香紫苏醇的提取，提取液离心固液分离后，沉淀再次用醇溶剂提取离心，反复提取离心，共提取离心3
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5次，合并离心上清液，浓缩至干，得到提取物；3)向提取物中加入溶剂，50
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60摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液结晶，固液分离，得到结晶母液和纯化的香紫苏醇产品I；4)获得的结晶母液直接过硅胶层析柱，并依次用正己烷和乙酸乙酯进行洗脱，正己烷(体积ml)：硅胶(质量g)＝5～8:1，乙酸乙酯(体积ml)：硅胶(质量g)＝5～8:1，收集含香紫苏醇的组分，浓缩至干；5)干燥后含香紫苏醇组分的样品加入溶剂，50
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60摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液结晶，得到纯化的香紫苏醇产品II。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所使用的醇溶剂为体积分数为5...
【专利技术属性】
技术研发人员：栾宏伟，周雍进，
申请(专利权)人：辽宁蒽进生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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