一种妥布霉素的微生物限度检测方法技术

本发明专利技术提供一种妥布霉素的微生物限度检测方法，属于妥布霉素检测技术领域，包括：配制目标菌液和稀释液；取供试品，加入稀释液制备妥布霉素供试液；利用妥布霉素供试液以稀释液作为冲洗液，冲洗制备得到供试检查样品，以及再通过添加目标菌液制备得到的阳性对照样品；基于冲洗液制备得到阴性对照样品；取阳性对照样品、供试检查样品和阴性对照样品分别进行平板划线培养并分别检查菌落检出结果。本发明专利技术的妥布霉素的微生物限度检测方法通过在稀释液中加入中和剂并以加入中和剂的稀释液作为冲洗液进行对样品的冲洗处理，所加入的中和剂能够有效消除样品抑菌性，降低稀释倍数提高检出率。率。

【技术实现步骤摘要】
一种妥布霉素的微生物限度检测方法


[0001]本专利技术属于妥布霉素检测
，尤其涉及一种妥布霉素的微生物限度检测方法。

技术介绍

[0002]妥布霉素(Tobramycin)，别名托普霉素，分子式为C
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H
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N5O9，分子量为467.52，是一种氨基糖苷类抗生素。临床上主要适用于治疗革兰阴性杆菌所致的新生儿脓毒血症、败血症、中枢神经系统感染(包括脑膜炎)、泌尿生殖系统感染、肺部感染等疾病。妥布霉素的制剂类型有注射剂(如硫酸妥布霉素注射液)、滴眼剂(如妥布霉素滴眼液)、吸入制剂(妥布霉素吸入溶液)等。
[0003]由于妥布霉素的抗生素特性其抑菌性非常强，特别是对金黄色葡萄球菌抑制尤为明显。据现有的公开文献所知，其微生物限度的检查的方法均为薄膜过滤法，不存在中和剂，样品需要高倍数稀释(1:1000稀释级别)和大量冲洗，方可消除抑菌性，其质量标准的微生物含量高(如需氧菌总数不得过1000cfu/g)。
[0004]总之，现有的妥布霉素的微生物限度检测方法存在如下问题：
[0005]1、样品检验稀释倍数高，导致其质量标准的微生物含量高(如需氧菌总数的不得过1000cfu/g)，对于做成需要控制内毒素的无菌制剂而言十分不利(通常微生物菌数越多内毒素含量越高)；
[0006]2、高倍数稀释，提高了样品检验超标的风险，检测的平皿均不长菌即＜1000cfu/g，若长菌2cfu即2000cfu/g，检测出极少菌即可能导致超质量标准。为了避免出现假阳性，对检验环境、检验人员的操作要求都提高了，大大降低了检验效率。

技术实现思路

[0007]为解决上述问题，本专利技术提供一种妥布霉素的微生物限度检测方法，包括：
[0008]配制目标菌液和稀释液；其中，所述稀释液为制备过程中加入中和剂的稀释液；所述目标菌液包括大肠埃希菌液、金黄色葡萄球菌液、铜绿假单胞菌液、沙门氏菌液和耐胆盐革兰阴性菌液；
[0009]取供试品，加入所述稀释液制备妥布霉素供试液；
[0010]利用所述妥布霉素供试液，以所述稀释液作为冲洗液，冲洗制备得到供试检查样品，以及再通过添加所述目标菌液制备得到的阳性对照样品；
[0011]基于所述冲洗液制备得到阴性对照样品；
[0012]取所述阳性对照样品、所述供试检查样品和所述阴性对照样品分别进行平板划线培养，并分别检查平板划线培养后的所述阳性对照样品、供试检查样品和所述阴性对照样品的菌落检出结果；
[0013]优选地，所述中和剂为聚山梨酯80。
[0014]进一步的，所述稀释液的配置方法包括：
[0015]取氯化钠
‑
蛋白胨缓冲溶液试药，加入聚山梨酯80混合得到所述稀释液。
[0016]进一步的，所述取氯化钠
‑
蛋白胨缓冲溶液试药，加入聚山梨酯80混合得到所述稀释液，包括：
[0017]取pH7.0氯化钠
‑
蛋白胨缓冲溶液试药，加入水后再加入聚山梨酯80溶解并混合和灭菌，即得到所述稀释液；
[0018]其中，聚山梨酯80的加入量为加入水量的0.1％。
[0019]进一步的，所述配制所述目标菌液，包括：
[0020]取试验菌株分别加入溶解液中混合，分别得到大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌和耐胆盐革兰阴性菌对应的菌悬液，并以所述菌悬液作为所述目标菌液；
[0021]其中，所述菌悬液符合浓度条件为：0.1mL所述目标菌液中含菌量≤100cfu。
[0022]进一步的，所述菌悬液的保存和使用方法为：
[0023]若所述菌悬液在制备后放置于室温条件下保存，则使用时间为：2小时内使用；
[0024]若所述菌悬液在制备后放置于2
‑
8℃保存，则使用时间为：24小时内使用。
[0025]进一步的，若所述目标菌液为大肠埃希菌液、金黄色葡萄球菌液、铜绿假单胞菌液和沙门氏菌液中任意一种，则所述取供试品，加入所述稀释液制备妥布霉素供试液，包括：
[0026]取供试品，用10倍的所述稀释液溶解，即得到稀释比例为1:10的所述妥布霉素供试液；
[0027]若所述目标菌液为耐胆盐革兰阴性菌，则所述取供试品，加入所述稀释液制备妥布霉素供试液，包括：
[0028]取供试品，用10倍的所述胰酪大豆胨液体培养基溶解，在20
‑
25℃预培养2h，即得到稀释比例为1:10的所述妥布霉素供试液。
[0029]若所述目标菌液为大肠埃希菌液、金黄色葡萄球菌液、铜绿假单胞菌液和沙门氏菌液中任意一种，所述利用所述妥布霉素供试液，以所述稀释液作为冲洗液，冲洗制备得到供试检查样品，以及再通过添加所述目标菌液制备得到的阳性对照样品，包括：
[0030]取含有滤膜的滤筒，利用所述稀释液浸湿所述滤筒的滤膜，加入10mL所述妥布霉素供试液，滤干，即得到第一预处理滤膜；
[0031]利用所述冲洗液，将所述第一预处理滤膜基于所述稀释液通过第一冲洗程序进行冲洗，即得到含稀释液样本；
[0032]取所述含稀释液样本，加入所述目标菌液，滤干后转移滤膜至100mL的胰酪大豆胨液体培养基中，作为所述阳性对照样品；以及，取所述含稀释液样本，滤干后转移滤膜至区别于所述阳性对照样品的100mL的胰酪大豆胨液体培养基中，作为所述供试检查样品；
[0033]若所述目标菌液为耐胆盐革兰阴性菌液，所述利用所述妥布霉素供试液，以所述稀释液作为冲洗液，冲洗制备得到供试检查样品，以及再通过添加所述目标菌液制备得到的阳性对照样品，包括：
[0034]取含有滤膜的滤筒，利用所述稀释液浸湿所述滤筒的滤膜，加入10mL所述妥布霉素供试液，滤干，即得到第一预处理滤膜；
[0035]利用所述冲洗液，将所述第一预处理滤膜基于所述稀释液通过第一冲洗程序进行冲洗，即得到含稀释液样本；
[0036]取一份所述含稀释液样本，加入大肠埃希菌液，再取另一份苏搜狐含稀释液样本加入铜绿假单胞菌液，两份均滤干后分别转移滤膜至100mL的胰酪大豆胨液体培养基中，作为两个所述阳性对照样品；以及，再取一份所述含稀释液样本，滤干后转移滤膜至区别于所述阳性对照样品的100mL的肠道菌增菌液体培养基中，作为所述供试检查样品；
[0037]优选地，所述第一冲洗程序包括：
[0038]对所述第一预处理滤膜重复进行4次第一冲洗流程后得到滤干品，再将所述滤干品进行第二冲洗流程；
[0039]其中，所述第一冲洗流程为：
[0040]取所述第一预处理滤膜加入100mL的所述冲洗液冲洗，滤干后，再取10mL冲洗液冲洗容器内壁，再滤干；
[0041]所述第二冲洗流程为：
[0042]取所述滤干品，加入100mL的所述冲洗液冲洗，即得到所述含稀释液样本；
[0043]优选地，所述含稀释液样本中的所述目标菌液加入量不大于100cfu。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种妥布霉素的微生物限度检测方法，其特征在于，包括：配制目标菌液和稀释液；其中，所述稀释液为制备过程中加入中和剂的稀释液；所述目标菌液包括大肠埃希菌液、金黄色葡萄球菌液、铜绿假单胞菌液、沙门氏菌液和耐胆盐革兰阴性菌液；取供试品，加入所述稀释液制备妥布霉素供试液；利用所述妥布霉素供试液，以所述稀释液作为冲洗液，冲洗制备得到供试检查样品，以及再通过添加所述目标菌液制备得到的阳性对照样品；基于所述冲洗液制备得到阴性对照样品；取所述阳性对照样品、所述供试检查样品和所述阴性对照样品分别进行平板划线培养，并分别检查平板划线培养后的所述阳性对照样品、供试检查样品和所述阴性对照样品的菌落检出结果；优选地，所述中和剂为聚山梨酯80。2.如权利要求1所述妥布霉素的微生物限度检测方法，其特征在于，所述稀释液的配置方法包括：取氯化钠
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蛋白胨缓冲溶液试药，加入聚山梨酯80混合得到所述稀释液。3.如权利要求2所述妥布霉素的微生物限度检测方法，其特征在于，所述取氯化钠
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蛋白胨缓冲溶液试药，加入聚山梨酯80混合得到所述稀释液，包括：取pH7.0氯化钠
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蛋白胨缓冲溶液试药，加入水后再加入聚山梨酯80溶解并混合和灭菌，即得到所述稀释液；其中，聚山梨酯80的加入量为加入水量的0.1％。4.如权利要求1所述妥布霉素的微生物限度检测方法，其特征在于，所述配制所述目标菌液，包括：取试验菌株分别加入溶解液中混合，分别得到大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌和耐胆盐革兰阴性菌对应的菌悬液，并以所述菌悬液作为所述目标菌液；其中，所述菌悬液符合浓度条件为：0.1mL所述目标菌液中含菌量≤100cfu。5.如权利要求4所述妥布霉素的微生物限度检测方法，其特征在于，所述菌悬液的保存和使用方法为：若所述菌悬液在制备后放置于室温条件下保存，则使用时间为：2小时内使用；若所述菌悬液在制备后放置于2
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8℃保存，则使用时间为：24小时内使用。6.如权利要求1所述妥布霉素的微生物限度检测方法，其特征在于，若所述目标菌液为大肠埃希菌液、金黄色葡萄球菌液、铜绿假单胞菌液和沙门氏菌液中任意一种，则所述取供试品，加入所述稀释液制备妥布霉素供试液，包括：取供试品，用10倍的所述稀释液溶解，即得到稀释比例为1:10的所述妥布霉素供试液；若所述目标菌液为耐胆盐革兰阴性菌，则所述取供试品，加入所述稀释液制备妥布霉素供试液，包括：取供试品，用10倍的所述胰酪大豆胨液体培养基溶解，在20
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25℃预培养2h，即得到稀释比例为1:10的所述妥布霉素供试液。7.如权利要求1所述妥布霉素的微生物限度检测方法，其特征在于，若所述目标菌液为大肠埃希菌液、金黄色葡萄球菌液、铜绿假单胞菌液和沙门氏菌液
中任意一种，所述利用所述妥布霉素供试液，以所述稀释液作为冲洗液，冲洗制备得到供试检查样品，以及再通过添加所述目标菌液制备得到的阳性对照样品，包括：取含有滤膜的滤筒，利用所述稀释液浸湿所述滤筒的滤膜，加入10mL所述妥布霉素供试液，滤干，即得到第一预处理滤膜；利用所述冲洗液，将所述第一预处理滤膜基于所述稀释液通过第一冲洗程序进行冲洗，即得到含稀释液样本；取所述含稀释液样本，加入所述目标菌液，滤干后转移滤膜至100mL的胰酪大豆胨液体培养基中，作为所述阳性对照样品；以及，取所述含稀释液样本，滤干后转移滤膜至区别于所述阳性对照样品的100mL的胰酪大豆胨液体培养基中，作为所述供试检查样品；若所述目标菌液为耐胆盐革兰阴性菌液，所述利用所述妥布霉素供试液，以所述稀释液作为冲洗液，冲洗制备得到供试检查样品，以及再通过添加所述目标菌液制备得到的阳性对照样品，包括：取含有滤膜的滤筒，利用所述稀释液浸湿所述滤筒的滤膜，加入10mL所述妥布霉素供试液，滤干，即得到第一预处理滤膜；利用所述冲洗液，将所述第一预处理滤膜基于所述稀释液通过第一冲洗程序进行冲洗，即得到含稀释液样本；取一份所述含稀释液样本，加入大肠埃希菌液，再取另一份苏搜狐含稀释液样本加入铜绿假单胞菌液，两份均滤干后分别转移滤膜至100mL的胰酪大豆胨液体培养基中，作为两个所述阳性对照样品；以及，再取一份所述含稀释液样本，滤干后转移滤膜至区别于所述阳性对照样品的100mL的肠道菌增菌液体培养基中，作为所述供试检查样品；优选地，所述第一冲洗程序包括：对所述第一预处理滤膜重复进行4次第一冲洗流程后得到滤干品，再将所述滤干品进行第二冲洗流程；其中，所述第一冲洗流程为：取所述第一预处理滤膜加入100mL的所述冲洗液冲洗，滤干后，再取10mL冲洗液冲洗容器内壁，再滤干；所述第二冲洗流程为：取所述滤干品，加入100mL的所述冲洗液冲洗，即得到所述含稀释液样本；优选地，所述含稀释液样本中的所述目标菌液加入量不大于100cfu。8.如权利要求1所述妥布霉素的微生物限度检测方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛海安，黄伟容，陈世坤，赖灿越，孟文伟，莫秋兰，舒淼，练昌宏，
申请(专利权)人：丽珠集团新北江制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：