肝脏脂肪性肝炎的体外模型制造技术

本发明专利技术涉及制备非酒精性脂肪性肝炎的体外模型的方法。外模型的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肝脏脂肪性肝炎的体外模型
[0001]本专利技术涉及制备非酒精性脂肪性肝炎的体外模型的方法。

技术介绍

[0002]非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种迅速出现的公共卫生危机，影响了多达1/3的美国人口、75％的2型糖尿病个体和95％的肥胖个体。在NAFLD疾病谱系的早期，非酒精性脂肪肝(NAFL)是良性而且无症状的，其特征为肝细胞内脂肪堆积；然而，这种表型可能进展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，这是一种包括脂肪变性、炎症和肝细胞气球样变性的严重疾病。
[0003]如果不加治疗，则NASH可能进一步进展为肝硬化和或肝细胞癌，通常导致肝移植或死亡。NASH是一种复杂的疾病，其成因与多种因素有关，包括遗传、代谢综合征和/或如饮食和运动等外部因素，使得甄别新疗法具有挑战性(Dongiovanni P等人，Curr Pharm Des.2018)。
[0004]正在开发的NASH疗法的作用机制千差万别并靶向疾病过程中非常不同的方面和阶段，这使得如实再现NASH的模型的开发非常具有挑战性。
[0005]尽管永生化的人细胞系如Huh7、HepG2或iPSC来源的肝细胞可以在培养中诱导成脂肪变性表型，但多项研究表明，这些细胞几乎不能反映天然肝脏代谢功能。
[0006]对于共培养方法，使用分化或功能不良的细胞系、缺乏对构成肝脏的不同肝细胞类型的数量和细胞比率的控制(Hurrell T等人,Cells.2020)不能完全重现NASH表型(InSphero肝脏显微组织，Mukherjee S等人,Am J Transl Res.2019)。
[0007]为了充分模拟这种疾病的复杂病理，需要仔细地选择体内条件并转化为体外设置。因此，对提供一种模拟该病过程中肝脏发生的生理行为的NASH体外模型的需求仍然未得到满足。

技术实现思路

[0008]本专利技术涉及含有以精确受控的量接种的多种人肝细胞类型的体外球体设置。
[0009]因此，本专利技术涉及一种充分模拟NASH表型的肝球体以及制备其的方法。
[0010]在第一方面，本专利技术涉及一种制备肝球体的方法，所述方法包括一起接种和培养10至60份人肝细胞(HH)、4至30份人星状细胞(HSC)、1至10份人肝内皮细胞(LEC)和1至10份库弗细胞(KC)，以及在允许形成肝球体的条件下培养所述细胞。在一个特别的实施方式中，所述方法包括一起接种和培养500至3000个HH、200至1500个HSC、50至500个LEC和50至500个KC。
[0011]优选地，本专利技术涉及一种制备肝球体的方法，所述方法包括一起接种和培养20至50份HH、5至20份HSC、3至7份人LEC和3至7份KC。
[0012]在另一方面，本专利技术涉及一种诱导NASH体外模型的方法，其中所述方法包括在适合诱导NASH表型的条件下培养本文所述的肝球体。
[0013]本专利技术还涉及本专利技术的NASH体外模型的使用方法。
[0014]本专利技术是用于NASH体外建模，从而模拟从脂肪变性到更严重疾病状态如纤维化NASH的NASH发病机制的相关工具。
附图说明
[0015]图1：在“NASH诱导培养基”中培养6天后球体的HES(苏木素
‑
伊红
‑
番红)着色，显示了典型的NASH特征：脂肪变性(箭头)和气球样变性肝细胞(圆圈)
[0016]图2：在“NASH诱导培养基”中培养6天后球体的PS(天狼猩红)染色，显示了中度纤维化(4.09％)，由红色染色的胶原纤维(星号)表明
[0017]图3：在“NASH诱导培养基”中培养6天后InSphero 3D InSight
TM
肝模型的HES着色：未见脂肪变性，可见大量气球样变性的肝细胞(圆圈)
[0018]图4：在“NASH诱导培养基”中培养6天后InSphero 3D InSight
TM
肝脏模型的PS染色，显示了极高量的纤维化(18.88％)，由红色染色的胶原纤维(星号)表明
[0019]图5：制备后24小时(A)和9天(B)时维持在培养物中的球体的形态。U和S分别表示
‘
未处理
’
和
‘
受刺激
’
的球体。刺激(S)9天后的形态变化是显著的。A、B、C和D分别对应表1提到的人肝细胞供体，编号1号和2号分别对应表2提到的HSC供体。对于所有HH和HSC组合，库弗细胞和肝内皮细胞供体都保持不变。
[0020]图6：制备后24小时(A)和9天(B)时培养物中的脂肪变性基线水平(表示为Adipored RFU，相对荧光单位)。A、B、C和D分别对应表1提到的人肝细胞供体，编号1号和2号分别对应表2提到的HSC供体。对于所有HH和HSC组合，库弗细胞和肝内皮细胞供体都保持不变(n＝6)。
[0021]图7：刺激9天后的脂肪变性水平。A、B、C和D分别对应表1提到的人肝细胞供体，编号1号和2号分别对应表2提到的HSC供体。对于所有HH和HSC组合，库弗细胞和肝内皮细胞供体都保持不变(n＝6)。
[0022]图8：在培养第0天(A)和第9天(B)时的白介素
‑
8浓度。IL
‑
8浓度以pg/mL表示。A、B、C和D分别对应表1提到的人肝细胞供体，编号1号和2号分别对应表2提到的HSC供体。对于所有HH和HSC组合，库弗细胞和肝内皮细胞供体都保持不变(n＝6)。
[0023]图9：NASH培养条件下9天后的白介素
‑
8浓度。IL
‑
8浓度以pg/mL为单位，相对于未处理的样品归一化(模拟样品的浓度
‑
未受刺激的样品的浓度；n＝6)。A、B、C和D分别对应表1提到的人肝细胞供体，编号1号和2号分别对应表2提到的HSC供体。对于所有HH和HSC组合，库弗细胞和肝内皮细胞供体都保持不变。
具体实施方式
[0024]尽管对NASH非常感兴趣，但仍然缺乏普通治疗策略，目前正在开发的30多种不同的靶标(PPAR调节剂、抗纤维化/抗炎调节剂、葡萄糖途径调节剂、脂质调节剂)证明了这一点。这可能源于缺乏对疾病的理解以及用于鉴定和验证靶标的实验模型。
[0025]本专利技术描述了用于NASH建模的可再现且可控的肝球体形成。
[0026]定义
[0027]如本文所用，术语“约”用于细胞培养天数时表示与所述天数完全对应的时间段，例如对于一天是24小时、对于2天是48小时等，但也表示有+/
‑
4小时容许偏差的时间段。例
如，约1天指20至28小时，约2天指44至52小时，约6天指140至148小时，约7天指164至172小时等。
[0028]此外，术语“约”用于浓度值时指该浓度值的+/
‑
10％，如该浓度值的+/
‑
5％。
[0029]在本专利技术的上下文中，术语“份”用于细胞类型时是指所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备三维(3D)肝球体的方法，所述方法包括一起接种20至50份人肝细胞(HH)、5至20份人星状细胞(HSC)、3至7份人肝内皮细胞(LEC)和3至7份库弗细胞(KC)，以及在允许形成肝球体的条件下培养所述细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是人原代细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括一起接种并培养1800至2200个HH、810至990个HSC、135至165个LEC和135至165个KC。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法包括一起接种并培养2000个HH、900个HSC、150个LEC和150个KC。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，所述方法包括：
‑
第一步，在包含血清和肝细胞生长因子(HGF)的培养基中培养所述细胞；以及
‑
第二步，在包含HGF的无血清培养基中培养所述细胞；其中所述第二培养基中的HGF浓度为所述第一培养基中的HGF浓度的至少1.5倍。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一步进行了至少5天。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述第一步进行了约7天。8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述第二步进行了至少4天。9.一种肝球体，所述肝球体能通过根据权利要求1至8中任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪尧姆，
申请(专利权)人：基恩菲特公司，
类型：发明
国别省市：