网状路径产物定向合成制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及网状路径产物定向合成。与利用天然微生物内源路径转化甾体底物相比，本发明专利技术在酵母底盘下，利用重新构建人工异源网状路径，通过理性组合路径组分蛋白，可实现定向合成节点产物。通过组合表达不同催化特异性的路径组分同源蛋白，可实现路径转化效率的进一步提升。同时利用在微生物底盘下构建人工孕烯醇酮合成路径，并通过引入特定下游雄烯二酮合成路径组分，实现以简单碳源为底物，定向合成雄烯二酮路径节点化合物。定向合成雄烯二酮路径节点化合物。

【技术实现步骤摘要】
网状路径产物定向合成


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及网状路径产物定向合成。

技术介绍

[0002]脊索动物中，甾体类激素合成路径由众多非特异性催化酶组成，这些酶可修饰多种结构相似的底物，因而酶之间往往共用多个底物，路径间反应交叉最终使得甾体合成路径呈现呈复杂网状催化，这大大增加了微生物定向异源合成网状路径中间节点化合物的难度。
[0003]甾体激素是一类以环戊烷多氢菲母核为基本结构是四环脂肪族碳氢化合物，该类化合物种类繁多，目前全世界生产的甾体药物已有400多种，以其抗炎、抗过敏、调节内分泌等功效得到广泛应用，到2017年甾体激素药物全球销售额达1000亿美元，为第二大类化学药物。由CYP17
‑
3β
‑
HSD构成的“孕烯醇酮
‑
雄烯二酮”合成路径位于脊椎动物类固醇合成途径中的交叉路口，其中包含多种甾体激素药物的关键前体(孕烯醇酮、孕酮、17
‑
羟基孕酮、17
‑
羟基孕烯醇酮、DHEA、雄烯二酮、睾酮)。
[0004]甾体激素中间体生产工艺的发展历经植物提取皂素法、化学全合成法、半合成法、新型的微生物合成法等阶段。植物提取法和微生物转化法是生产甾体激素类药物的主要方法。但动植物提取法成本较高，来源受限、同时伴有环境污染等问题。化学全合成甾体分子会涉及流程长、反应复杂、环境污染等局限。
[0005]与从动物来源分离甾体相比，微生物合成甾体具有低病毒/朊病毒污染的风险。微生物合成甾体也可以避免化学合成涉及的繁琐反应步骤。在过去的研究中，酿酒酵母、大肠杆菌、解脂耶氏酵母都被应用于孕烯醇酮或其他甾体合成的研究中，其中酿酒酵母的实验中，实现了由葡萄糖为底物从头合成孕烯醇酮及下游产物氢化可的松，酿酒酵母、大肠杆菌、解脂耶氏酵母实现了由生物转化甾醇底物合成孕烯醇酮。通过引入P450scc催化系统至酿酒酵母或大肠杆菌中，并在培养环境中添加P450scc催化系统的直接底物甾醇，可实现孕烯醇酮的生物转化。在异源表达P450scc系统及P450c17系统的解脂酵母二倍体底盘细胞的培养环境中进行固醇饲喂，可使之以甾醇为底物进行生物转化，用于合成孕烯醇酮或17α
‑
羟基孕烯醇酮。而甾体类较强的疏水性、常用微生物分枝杆菌的鲁棒性较差、灭菌成本较高，使微生物转化效率较低。
[0006]合成生物学提供了一种新的微生物合成法，人工构建异源合成路径的功能微生物，能低能耗、高效、环境友好地生产特定结构的甾体激素类药物，可以仅以葡萄糖、甘油等为单一碳源即可生产特定甾体类化合物。1998年，Catherine Duport等通过敲除酿酒酵母固有基因erg5并引入外源基因DHCR7，实现了菜油甾醇的合成，提供了孕烯醇酮的合成前体；而后引入牛来源的P450scc催化系统和3β
‑
HSD，实现了以葡萄糖为底物，孕酮的从头合成。2019年，本课题组基于高产菜油甾醇底盘，通过酶来源筛选和启动子辅配，构建了从头合成孕烯醇酮的解脂酵母工程菌。2003年，Florence M
é
nard Szczebara等在高产孕酮的酿酒酵母底盘基础上，对ATF2敲除，同时引入CYP17A1、CYP21A1、CYP11B1，成功实现了氢化可
sapiens(I型，L237S突变)或Homo sapiens(II型，L236S突变)的3β
‑
HSD；和/或
[0038](IV)、来源于Sus scrofa的mCYP11A1。
[0039]在上述研究的基础上，本专利技术还提供了质粒，包括所述表达元件。
[0040]本专利技术还提供了宿主，包括所述质粒。
[0041]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述宿主包括模块一、模块二、模块三、模块四、模块五、模块六、模块七、模块A、模块B、模块C或模块D中的一种或多种：
[0042]所述模块一包括来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Xenopus laevis的CYP17A1和POR；所述模块一包括IntD整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；和/或
[0043]所述模块二包括来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Susscrofa的CYB5；所述模块二包括IntB整合位点和/或Ura3标签；和/或
[0044]所述模块三包括来源于Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsis thaliana、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homo sapiens(II型)、Homo sapiens(I型，L237S突变)或Homo sapiens(II型，L236S突变)的3β
‑
HSD；所述模块三连接的载体包括pINA1269
‑
Nat；和/或
[0045]所述模块四包括来源于Equus caballus的CYP17A1和POR；所述模块四包括IntF整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；和/或
[0046]所述模块五包括：来源于Ovis aries的CYP17A1和POR；所述模块五敲除Leu2标签；和/或
[0047]所述模块六包括；来源于Homo sapiens(II型)的3β
‑
HSD；所述模块六包括IntC整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；和/或
[0048]所述模块七包括：来源于Mesocricetus auratus的CYP17A1和POR、来源于Homo sapiens(II型)的3β
‑
HSD和来源于Vaccinia virus的3β
‑
HSD；所述CYP17A1和POR包括IntD整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；所述来源于Vaccinia virus的3β
‑
HSD连接的载体包括pINA1269
‑
Nat；所述来源于Homo sapiens(II型)的3β
‑
HSD连接的载体包括pUC57
‑
Kan
‑
Simple；和/或
[0049]所述模块A包括：来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Xenopus laevis的CYP17A1和POR；所述模块A包括IntD整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；和/或
[0050]所述模块B包括：来源于Equus caballus、Ovis aries或Mesocricetus auratus的CYB5；所述模块B包括IntB整合位点和/或Ura3标签；和/或
[0051]所述模本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.表达如下任意项在合成甾体类化合物和/或甾体激素药物中的应用：(I)、来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Xenopus laevis的CYP17A1和POR；和/或(II)、来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Sus scrofa的CYB5；和/或(III)、来源于Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsis thaliana、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homo sapiens(II型)、Homo sapiens(I型，L237S突变)或Homo sapiens(II型，L236S突变)的3β
‑
HSD；和/或(IV)、来源于Sus scrofa的mCYP11A1。2.模块，其特征在于，包括表达如下任意项：(I)、来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Xenopus laevis的CYP17A1和POR；和/或(II)、来源于Equus caballus、Ovis aries或Mesocricetus auratus或Sus scrofa的CYB5；和/或(III)、来源于Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsis thaliana、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homo sapiens(II型)、Homo sapiens(I型，L237S突变)或Homo sapiens(II型，L236S突变)的3β
‑
HSD；和/或(IV)、来源于Sus scrofa的mCYP11A1。3.质粒，其特征在于，包括如权利要求2所述的表达元件。4.宿主，其特征在于，包括如权利要求3所述的质粒。5.如权利要求4所述的宿主，其特征在于，包括模块一、模块二、模块三、模块四、模块五、模块六、模块七、模块A、模块B、模块C或模块D中的一种或多种：所述模块一包括来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Xenopus laevis的CYP17A1和POR；所述模块一包括IntD整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；和/或所述模块二包括来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Susscrofa的CYB5；所述模块二包括IntB整合位点和/或Ura3标签；和/或所述模块三包括来源于Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsis thaliana、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homo sapiens(II型)、Homo sapiens(I型，L237S突变)或Homo sapiens(II型，L236S突变)的3β
‑
HSD；所述模块三连接的载体包括pINA1269
‑
Nat；和/或所述模块四包括来源于Equus caballus的CYP17A1和POR；所述模块四包括IntF整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；和/或所述模块五包括：来源于Ovis aries的CYP17A1和POR；所述模块五敲除Leu2标签；和/或所述模块六包括；来源于Homo sapiens(II型)的3β
‑
HSD；所述模块六包括IntC整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；和/或所述模块七包括：来源于Mesocricetus auratus的CYP17A1和POR、来源于Homo sapiens(II型)的3β
‑
HSD和来源于Vaccinia virus的3β
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，张若思，王颖，肖文海，姚明东，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：