转基因大豆MON87712品系实时荧光定量检测引物、检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了转基因大豆MON87712品系实时荧光定量检测引物、检测方法和试剂盒。所述的检测引物如下所示：F：5

【技术实现步骤摘要】
转基因大豆MON87712品系实时荧光定量检测引物、检测方法和试剂盒

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[0001]本专利技术属于转基因产品检测领域，具体涉及一种转基因大豆MON87712品系特异性定量检测引物探针、检测方法和试剂盒。

技术介绍
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[0002]MON87712孟山由孟山都公司研发转基因大豆品系，通过农杆菌介导含有bbx32基因的质粒载体PV
‑
GMAP5779插入到常规大豆A3525研发而成。bbx32基因可表达相应的蛋白，它可与内源性转录因子作用，从而促进植株的生长和生殖发育。2013在美国获得批准上市。
[0003]目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度，品系特异性PCR(转化事件特异性)(Event
‑
specific PCR)检测的目标序列是外源插入序列与植物基因组间连接区，相较于筛选PCR(Screening PCR)、基因特异性PCR(Gene
‑
specific PCR)、构建特异性PCR(Construct
‑
specific PCR)具有更加高的具有高特异性，能用于检测鉴定相同质粒转化的转基因具体品系，是目前转基因品系鉴定检测技术研究和实际检测工作中的重要方法。
[0004]目前大豆转基因转基因检测中，特别是定量检测中，不管是基于标准曲线的定量检测方法，还是基于拷贝数百分比的数字PCR定量检测方法，在进行转基因品系检测时，需要同时测定转基因大豆品系的外源基因和内源基因，目前采用的PCR检测时，大豆内源基因lectin的退火温度为60℃，现有MON87712品系特异性测试方法的退火温度设置在54℃及以下，相差较大，采用60℃温度时，大豆内源基因lectin能正常扩增，但MON87712品系特异性方法不能正常扩增，而采用54℃及以下的退火温度进行PCR反应时内源基因lectin难以获得准确的Ct值或数字PCR测试的基因拷贝数的结果，无法进行定量检测或造成结果不准确；如果分别进行单独的两次PCR测定(一次为60℃退火，一次为54℃退火)，加大了检测工作量，增长了检测周期，也增加了检测人力和试剂成本。

技术实现思路
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[0005]本专利技术的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别转基因大豆MON87712品系特异性检测引物。
[0006]本专利技术通过分析比对MON87712特异性片段，设计引物和探针，可以使MON88712品系扩增在60℃完成退火，在同一反应中可以完成内源基因lectiin和MON87712品系特异性检测，可实现MON87712的定量检测并且更加方便和高效，可应用于实时荧光PCR和数字PCR定量检测MON87712品系。
[0007]本方法的建立可完善和我国转基因产品定量检测技术体系，保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，为进出境口岸监管部门提供转基因品系标识检测鉴定的方法，适用于转基因大豆MON87712品系特异性定量PCR精准检测。
[0008]本专利技术的转基因大豆MON87712品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所
述的检测引物如下所示：
[0009]MON87712
‑
F：5
’‑
GGCCGCAGGAGAAGTTATCA
‑3’
(如SEQ ID NO.1所示)；
[0010]MON87712
‑
R：5
’‑
TTTCTTTTTCTCCATATTGACCATCA
‑3’
(如SEQ ID NO.2所示)。
[0011]本专利技术还提供了一种转基因大豆MON87712品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针为MON87712
‑
P：5
’‑
FAM
‑
ATGAGTTTCGCGCCCC
–
MGB
‑3’
(如SEQ ID NO.3所示)，5
’
端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
[0012]本专利技术的转基因大豆MON87712品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
[0013]MON87712
‑
F：5
’‑
GGCCGCAGGAGAAGTTATCA
‑3’
；
[0014]MON87712
‑
R：5
’‑
TTTCTTTTTCTCCATATTGACCATCA
‑3’
；
[0015]所述的检测探针为MON87712
‑
P：5
’‑
FAM
‑
ATGAGTTTCGCGCCCC
–
MGB
‑3’
(如SEQ ID NO.3所示)，5
’
端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
[0016]本专利技术的转基因大豆MON87712品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0017](1)提取样品DNA的作为模板；
[0018](2)加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
[0019](3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品中是否含有转基因大豆MON87712品系。
[0020]优选，所述的步骤(2)的扩增反应扩增反应25μL体系为：Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L MON87712
‑
F和MON87712
‑
R各0.4μL，10μmol/L探针MON87712
‑
P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 8.7μL；反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
[0021]所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品中是否为转基因大豆MON87712品系的标准为：40个循环内，如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因大豆MON87712品系；40个循环内，如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不为转基因大豆MON87712品系。
[0022]本专利技术还提供转基因大豆MON87712品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0023](1)提取转基因大豆MON87712品系的基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入上述的检测引物、检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应；
[0024](2)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转基因大豆MON87712品系特异性实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MON87712
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F：5
’‑
GGCCGCAGGAGAAGTTATCA
‑3’
；MON87712
‑
R：5
’‑
TTTCTTTTTCTCCATATTGACCATCA
‑3’
。2.一种转基因大豆MON87712品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针为MON87712
‑
P：5
’‑
FAM
‑
ATGAGTTTCGCGCCCC
–
MGB
‑3’
，5
’
端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。3.根据权利要求2所述的转基因大豆MON87712品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为MGB。4.一种转基因大豆MON87712品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MON87712
‑
F：5
’‑
GGCCGCAGGAGAAGTTATCA
‑3’
；MON87712
‑
R：5
’‑
TTTCTTTTTCTCCATATTGACCATCA
‑3’
。所述的检测探针MON87712
‑
P如下所示：5
’‑
FAM
‑
ATGAGTTTCGCGCCCC
–
MGB
‑3’
，5
’
端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。5.一种转基因大豆MON87712品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样品DNA的作为模板；(2)加入权利要求1的检测引物和权利要求2的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品中是否为转基因大豆MON87712品系。...

【专利技术属性】
技术研发人员：关丽军，刘二龙，卢丽，李志勇，魏霜，郑冠津，
申请(专利权)人：黄埔海关技术中心，
类型：发明
国别省市：