一种特有鉴别胡杨派植物方法及使用试剂盒技术

本发明专利技术涉及林木分子辅助育种技术领域，尤其为一种特有鉴别胡杨派植物方法及使用试剂盒，可对不同杨属派系种间与进化过程中相对保守性基因EXPA1的克隆，比对分析派系间的序列变异规律，并通过派系间的序列特征分析，筛选得到胡杨派特异分子标记，以及用于区分杨属五大派系树种间的特有鉴别胡杨派树种的方法及鉴定试剂盒，利用本方案试剂盒及鉴别方法，可以鉴定胡杨派树种(特异扩增条带为456bp)，可以用于杨属间派系的鉴定、亲缘关系分析及进化路程分析等，并为杨树的分子标记辅助育种和品种遗传改良工作提供理论基础和技术支持，还可有效鉴定五莲杨不属于胡杨派树种，具有高灵敏性、特异性以及直观、简洁、准确等优点。准确等优点。准确等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种特有鉴别胡杨派植物方法及使用试剂盒


[0001]本专利技术涉及林木分子辅助育种
，具体为一种特有鉴别胡杨派植物方法及使用试剂盒。

技术介绍

[0002]杨树指杨柳科(Salicaceae)杨树(Populus L.)的所有树种的统称，是以无性繁殖为主、雌雄异株的落叶乔木。尹春英(2004)和栾鹖慧(2011)介绍到杨树适应范围广泛，遍及北美洲、亚洲、欧洲，有较强的适应性和抗逆性。杨树种类繁多，目前世界约有品种超过100种，我国杨树资源丰富，国内约有60种，且特有种多，西北、西南、华北及东北地区均有分布。
[0003]王战等(1984)根据形态特性、生物学属性及地理空间所处位置的不同，将杨属分为五大派：黑杨派(Sect.Aigeiros Duby)、白杨派(Sect.Lence Duby)、胡杨派(Sect.Turanga Bge)、青杨派(Sect.Tacamahaca Spach)和大叶杨派(Sect.Leucoides Spach)。
[0004]胡杨是杨树中最古老的物种，距今大约有300～600万年的历史，胡杨因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特有鉴定胡杨派树种的方法，步骤如下：步骤1，杨属基因组DNA扩展蛋白1即为EXPA1基因同源片段引物设计：利用毛果杨EXPA1基因DNA全长序列820bp～885bp的片段上下游设计引物对1；步骤2，五大派杨树基因组DNA同源EXPA1基因片段序列获得：提取五大派代表性树种DNA，利用序列表中的引物对1对以上模板进行PCR扩增；其次，将这五大派代表性物种的EXPA1基因片段进行克隆测序；步骤3，胡杨派特有引物对获得：将获得的五大派代表性物种的基因组DNA同源性EXPA1基因片段序列比对，挑选胡杨派在比对序列中特有部分，作为胡杨派物种区别其他四大派物种的特有片段，设计引物，即为引物对2；步骤4，验证特异引物对2的准确性：将收集的五大派杨树共计21个样本使用胡杨派专用试剂盒进行验证，结果显示，胡杨派的5个样本在扩增结果中均有456bp特异条带出现，而其他四大派树种的样本中均没有此特异条带产生；步骤5，鉴定五莲杨不属于胡杨派的物种：分别提取五莲杨雌株、雄株DNA，利用胡杨专用试剂盒进行鉴别，结果显示，五莲杨雌雄两样本中均无456bp特异条带产生，说明五莲杨雌株、雄株均不属于胡杨派的植物；所述五大派杨树分别为胡杨派、白杨派、黑杨派、青杨派和大叶杨派；所述选取的五大派杨树代表性树种分别为：胡杨派的胡杨、白杨派的鲁毛50、黑杨派的欧美杨107、青杨派的小叶杨和大叶杨派的大叶杨。2.根据权利要求1所述的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，所述的毛果杨基因组DNA EXPA1基因的片段序列位于第二个和第三个外显子之间，利用DNAMAN软件设计引物对，使其扩增产物在820bp～885bp。3.根据权利要求1所述的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，所述的五种杨树基因组DNA EXPA1基因同源片段序列获得包括PCR产物胶回收纯化，连接克隆载体即为pMD18
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T vector，转化大肠杆菌后阳性筛选和质粒提取后基因测序。4.根据权利要求1所述的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，所述胡杨派与其他四个派系差异较大片段的区别在于部分作为引物对的上游引物，下游引物在差异片段下游的382bp处。5.根据权利要求4所述的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，所述胡杨派与其他四个派系特有片段包括5'
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GCATTCCAATAGTTCTCACTCCACATTTTGGTGTATGCAAAAAAAAAA
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3'48bp片段。6.根据权利要求1至4任意一项所述的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系为：引物对列表中的引物对浓度均为10pmol/μl，上下游引物各取用0.3μl，7.5μl Premix Taq即为Ex Taq Version 2.0plus dye，0.4μl DNA模板，无菌水补至15μl。7.根据权利要求5的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40～60sec，35个循环，然后72℃充分延伸7min。8.根据权利要求1所述的一种特有鉴定胡杨派树种的试剂盒，其特征在于，利用以上方法可形成能够鉴定胡杨派树种的试剂盒，其试剂盒包括能够区别其他杨属四大派的引物对
2，PCR扩增体系和PCR扩增条件。9.根据权利要求8所述的一种特有鉴定胡杨派树种的试剂盒，其特征在于，PCR扩增体系为引物对列表中的引物对2浓度均为10pmol/μl，上下游引物各取用0.3μl，7.5μl Premix Taq即为Ex Taq Version 2.0plusdye，0.4μlDNA模板，无菌水补至15μl，其中PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40～60sec，35个循环，然后72℃充分延伸7min。10.根据权利要求1所述的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，所述引物对1的片段大小为820bp～885bp，其中引物对1包括PtA1F和PtA1R，其中Pt...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳，鲁仪增，徐吉臣，尹鹏，刘晓，王雪，仝伯强，解孝满，刘鵾，穆艳娟，畅盼，张利，王毅，李庆伟，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：