一种同时生产高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种同时生产高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶的方法，包括以下具体步骤：(1)种子制备；(2)接种和发酵：首先将产烟酰胺核糖激酶的种子液接种到初始培养基中进行一次发酵，检测OD

【技术实现步骤摘要】
一种同时生产高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶的方法及其应用


[0001]本专利技术属于发酵
，具体涉及一种同时生产高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶的方法。

技术介绍

[0002]NMN是NAD+的前体，而NAD+是人体中一种重要的物质，能够起到预防疾病产生和发展的作用；由于人体无法通过直接补充的方式增加NAD+含量，因此补充其前体成为补充NAD+的重要方式。
[0003]目前生产NMN的方法有化学合成法和生物催化法，化学法由于成本高且造成严重的环境污染，已逐渐被生物催化法取代。生物催化法是将ATP上的高能磷酸键通过烟酰胺核糖激酶转移至烟酰胺核糖上，形成NMN；同时，乙酰磷酸二胺上的高能磷酸根在乙酰磷酸激酶的作用下转移至副产物ADP上，循环形成ATP。但是现有技术中烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶需要具有特定比例，所以很难直接应用于NMN转化中去，并且目前的的生产方法具有成本高、转化率低的问题。
[0004]因此，如何提供一种成本低、转化率高的同时生产高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶的方法是亟需解决的一个问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种同时生产高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶的方法及其应用，通过以喷浆玉米纤维为发酵底物，接种产烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶的重组菌种，通过调控两种菌的接种比例和发酵条件，可以在短时间内获得具有特定比例的两种酶，直接应用于NMN转化中去。该方法具有成本低、转化率高的优点。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种同时生产高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶的方法，包括以下具体步骤：
[0008](1)种子制备：将产烟酰胺核糖激酶的菌种和产乙酰磷酸激酶的菌种分别活化、种子扩大培养后，得到产烟酰胺核糖激酶的种子液和产乙酰磷酸激酶的种子液，备用；
[0009](2)接种和发酵：首先将产烟酰胺核糖激酶的种子液接种到初始培养基中进行一次发酵，检测OD
600nm
≥60时，接种产乙酰磷酸激酶的种子液进行二次发酵，发酵6
‑
8h，检测OD
600nm
≥150时，停止发酵，得发酵液；
[0010](3)将发酵液过筛后，离心后弃去上清液，将所得菌泥即为高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶。
[0011]优选的，步骤(1)中所述扩大培养的方法为：
[0012]1)产烟酰胺核糖激酶的种子液：挑产烟酰胺核糖激酶菌种的单菌落接种到LB液体培养基中，37
±
1℃、180
‑
200rpm摇床振荡培养6
‑
8h，OD
600nm
＝4.0
‑
6.0，即可；
[0013]2)产乙酰磷酸激酶的种子液：挑产乙酰磷酸激酶菌种的单菌落接种到LB液体培养基中，37
±
1℃、180
‑
200rpm摇床振荡培养3
‑
5h，OD
600nm
＝2.0
‑
4.0，即可。
[0014]优选的，步骤(2)中所述初始培养基的制备方法为：
[0015]1)将喷浆玉米纤维添加到蒸汽爆破工艺试验台的汽爆缸中，在压力为1.5
‑
1.6MPa，温度190
‑
198℃条件下保持1.5
‑
2min，然后快速打开喷放阀，释放气缸压力；
[0016]2)将爆破处理后的喷浆玉米纤维和去离子水加入发酵罐中，115℃灭菌20min；
[0017]3)按照总质量3％的比例加入纤维素酶，控制转速为30
‑
40rpm，在50
±
1℃下水解18
‑
20h；然后调节PH至7.0，按照总质量2％的比例加入中性蛋白酶，控制转速为50
‑
60rpm，在37
±
1℃下水解12
‑
15h，得到两种酶解液的混合液，将发酵罐温度升至90℃，保持30min，降温至37℃；
[0018]4)将硫酸镁、三水合磷酸氢二钾和磷酸二氢钾加入去离子水中，115℃灭菌20min后，备用，接种种子液时一同加入发酵罐中。
[0019]优选的，步骤1)中所述汽爆缸的装填系数为0.8
‑
0.9。
[0020]优选的，步骤2)中所述喷浆玉米纤维和所述去离子水的固液比1:5
‑
6。
[0021]优选的，步骤4)中所述硫酸镁、所述三水合磷酸氢二钾和所述磷酸二氢钾的添加比例分别为所述两种酶解液的混合液质量的0.05％、1％和4％。
[0022]优选的，步骤(2)中所述产烟酰胺核糖激酶种子液的接种量为1
‑
1.5％；
[0023]所述一次发酵的条件为：温度37℃，转速200rpm，通风比1:1，压力0.025mpa。
[0024]优选的，步骤(2)中所述产乙酰磷酸激酶种子液的接种量为0.5
‑
0.8％；
[0025]所述二次发酵的条件为：温度37℃，转速150rpm，通风比1:1，压力0.020mpa。
[0026]如上述所述方法得到的高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶在NMN转化中的应用。
[0027]优选的，所述烟酰胺核糖激酶和所述乙酰磷酸激酶之和与烟酰胺核糖在进行转化时的质量比为1
‑
1.5:100。
[0028]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0029](1)本专利技术首次利用蒸汽爆破加酶解处理后的喷浆玉米纤维为发酵底物生产烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶，充分利用了喷浆玉米纤维丰富的营养物质和微量元素，发酵20h菌浓≥150.0、具有成本低、目的酶活高的优点；
[0030](2)本专利技术利用分批接种和分批控制发酵条件的方式实现两种菌的不同生长速度，进而得到特定比例的菌浓和酶活，烟酰胺核糖激酶：乙酰磷酸激酶＝8
‑
12:1，可以直接添加到底物中进行转化，节省了中间步骤；
[0031](3)本专利技术得到的混合酶活性高，可重复利用多次，有利于节约成本。
附图说明
[0032]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0033]图1为本专利技术对比例9发酵条件1下产烟酰胺核糖激酶菌种平均OD600nm值；
[0034]图2为本专利技术对比例9发酵条件1下产乙酰磷酸激酶菌种平均OD600nm值；
[0035]图3为本专利技术对比例9发酵条件2下产烟酰胺核糖激酶菌种平均OD600nm值；
[0036]图4为本专利技术对比例9发酵条件本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时生产高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：(1)种子制备：将产烟酰胺核糖激酶的菌种和产乙酰磷酸激酶的菌种分别活化、种子扩大培养后，得到产烟酰胺核糖激酶的种子液和产乙酰磷酸激酶的种子液，备用；(2)接种和发酵：首先将产烟酰胺核糖激酶的种子液接种到初始培养基中进行一次发酵，检测OD
600nm
≥60时，接种产乙酰磷酸激酶的种子液进行二次发酵，发酵6
‑
8h，检测OD
600nm
≥150时，停止发酵，得发酵液；(3)将发酵液过筛后，离心后弃去上清液，将所得菌泥即为高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶。2.根据权利要求1所述的一种同时生产高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶的方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩大培养的方法为：1)产烟酰胺核糖激酶的种子液：挑产烟酰胺核糖激酶菌种的单菌落接种到LB液体培养基中，37
±
1℃、180
‑
200rpm摇床振荡培养6
‑
8h，OD
600nm
＝4.0
‑
6.0，即可；2)产乙酰磷酸激酶的种子液：挑产乙酰磷酸激酶菌种的单菌落接种到LB液体培养基中，37
±
1℃、180
‑
200rpm摇床振荡培养3
‑
5h，OD
600nm
＝2.0
‑
4.0，即可。3.根据权利要求1所述的一种同时生产高活性烟酰胺核糖激酶和乙酰磷酸激酶的方法，其特征在于，步骤(2)中所述初始培养基的制备方法为：1)将喷浆玉米纤维在压力1.5
‑
1.6MPa，温度190
‑
198℃条件下爆破处理；2)将爆破处理后的所述喷浆玉米纤维和去离子水加入发酵罐中，115℃灭菌20min；3)按照总质量3％的比例加入纤维素酶，控制转速为30...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雷达，李纪伟，赵伟，张金祥，曹乐梅，齐翠萍，
申请(专利权)人：山东福洋生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：