本发明专利技术涉及一种乙肝病毒特异性的肽段以及四聚体与检测乙肝病毒特异性CD8+T细胞的试剂盒，属于医学技术领域。本发明专利技术提供了一种特异性的乙肝病毒的肽段，所述肽段的序列如SEQIDNO.1所示。根据该肽段构建四聚体，得到的四聚体稳定，对乙肝病毒特异性CD8+T细胞的检测率高，为后期乙肝病毒特异性免疫细胞的检测提供依据。提供依据。提供依据。
【技术实现步骤摘要】
一种乙肝病毒特异性的肽段以及四聚体与检测乙肝病毒特异性CD8+T细胞的试剂盒
[0001]本专利技术涉及医学
，尤其涉及一种乙肝病毒特异性的肽段以及四聚体与检测乙肝病毒特异性CD8+T细胞的试剂盒。
技术介绍
[0002]乙型病毒性肝炎(viral hepatitis B)是由乙型肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病。临床上表现为食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力。部分患者存在黄疸发热和肝大等。还有些患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌。可见乙型病毒性肝炎不容小觑。早发现早治疗能减轻乙型肝炎患者的损失。
[0003]乙肝病毒特异性T细胞与乙肝病毒感染慢性化和免疫介导的肝损伤和疾病进展密切相关，乙肝病毒特异性CD8+T细胞是宿主免疫控制的主要效应细胞。现阶段用于检测乙肝病毒特异性CD8+T细胞的方法为组织相容性抗原(HLA)
‑
肽四聚体结合流式细胞技术、质谱流式技术、酶联免疫斑点技术等，但质谱流式技术、酶联免疫斑点(Elispot)技术需要质谱流式细胞仪或酶联免疫斑点分析仪，设备要求高，并且在乙肝病毒特异性CD8+T细胞检测中的检出率和灵敏度还有待进一步提高。利用组织相容性抗原(HLA)
‑
肽四聚体结合流式细胞技术检测乙肝病毒特异性CD8+T细胞受HLA分型限制，目前尚缺少可以识别乙肝病毒A、B、C、D常见基因型的HLA
‑
肽四聚体。基于此提出本专利技术。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于提供一种乙肝病毒特异性的肽段以及四聚体与检测乙肝病毒特异性CD8+T细胞的试剂盒。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种乙肝病毒特异性的肽段，所述肽段的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术还提供了一种乙肝病毒特异性肽段的四聚体，包括所述的肽段。
[0008]作为优选，所述四聚体的制备方法为：
[0009](1)将所述的肽段与二甲基亚砜混合，得到浓度为8～12mg/mL的肽溶液；
[0010](2)将所述的肽溶液与Quick Switch
Tm
、肽交换因子混合，避光孵育3.5～4.5h，得到蛋白复合物；
[0011](3)将蛋白复合物与链霉亲和素
‑
藻红蛋白混合，得到四聚体。
[0012]作为优选，所述肽溶液与Quick Switch
Tm
混合的体积比为1:45～55；
[0013]所述肽溶液与肽交换因子混合液的体积比为1:1～2。
[0014]作为优选，所述肽交换因子为叠氮钠缓冲液；
[0015]所述叠氮钠缓冲液的浓度为0.06～0.08wt％。
[0016]作为优选，所述蛋白复合物与链霉亲和素
‑
藻红蛋白混合的摩尔浓度比为4～5:1。
[0017]本专利技术还提供了一种检测乙肝病毒特异性CD8+T细胞的试剂盒，所述试剂盒包括
如下组分：
[0018]四聚体、96孔培养板、阴性对照、阳性对照、培养液、洗液、Percp
‑
Cy5.5标记的CD3、APC标记的CD8。
[0019]作为优选，所述阴性对照的制备方法为：提取乙肝患者血液样品中的外周血单个核细胞，利用刺激剂2刺激所述的外周血单个核细胞，刺激培养至第3天加入白细胞介导素
‑
2，继续刺激培养3～5天，得到阴性对照；
[0020]所述刺激剂2中包括如下组分：
[0021]1640培养基、白细胞介导素
‑
12和牛血清白蛋白；
[0022]所述白细胞介导素
‑
12与1640培养基的质量体积比为1μg：9～11mL；
[0023]所述牛血清白蛋白与1640培养基的质量体积比为1g：9～11mL；
[0024]所述刺激剂2与外周血单个核细胞的体积比为1:0.8～1.2；
[0025]所述外周血单个核细胞的浓度为2～4
×
106个/mL；
[0026]所述白细胞介导素
‑
2的终浓度为50IU/mL。
[0027]作为优选，所述阳性对照的制备方法为：提取乙肝患者血液样品中的外周血单个核细胞，利用刺激剂3刺激所述的外周血单个核细胞，刺激培养至第3天加入白细胞介导素
‑
2，继续刺激培养3～5天，得到阳性对照；
[0028]所述刺激剂3包括如下组分：
[0029]1640培养基、白细胞介导素
‑
12、牛血清白蛋白和植物凝集素；
[0030]所述白细胞介导素
‑
12与1640培养基的质量体积比为1μg：9～11mL；
[0031]所述牛血清白蛋白与1640培养基的质量体积比为1g：9～11mL；
[0032]所述植物凝集素与1640培养基的质量体积比为25μg：9～11mL；
[0033]所述刺激剂3与外周血单个核细胞的体积比为1:0.8～1.2；
[0034]所述外周血单个核细胞的浓度为2～4
×
106个/mL；
[0035]所述白细胞介导素
‑
2的终浓度为50IU/mL。
[0036]作为优选，所述培养液为含有胎牛血清的1640培养基；
[0037]所述胎牛血清的终浓度为9～11wt％；
[0038]所述洗液为磷酸盐缓冲液。
[0039]本专利技术提供了一种乙肝病毒特异性的肽段以及四聚体与检测乙肝病毒特异性CD8+T细胞的试剂盒。本专利技术的肽段是乙肝病毒聚合酶特异性的。将其制备成四聚体后，可以用于检测乙肝病毒CD8+T细胞免疫应答反应。将该四聚体制备成流式细胞检测乙肝病毒的试剂盒较Elispot方法在检测乙肝病毒时的检出率高。
附图说明
[0040]图1为流式细胞检测乙肝病毒特异性四聚体直方图。
[0041]图2为流式细胞检测HLA
‑
A2阳性患者乙肝病毒特异性CD8+T细胞的散点图。
[0042]图3为临床阳性样本乙肝病毒特异性CD8+T细胞频率图。
具体实施方式
[0043]本专利技术提供了一种乙肝病毒特异性的肽段，所述肽段的序列如SEQ ID NO.1所示。
在本专利技术中所述肽段为乙肝病毒聚合酶422～430段的肽段；所述肽段的序列为NLSWLSLDV，该肽段在乙肝病毒基因型A、B、C、D各基因型中高度保守。在本专利技术中，所述肽段为合成肽段。
[0044]本专利技术还提供了一种乙肝病毒特异性肽四聚体，包括所述的肽段。
[0045]在本专利技术中，所述四聚体的制备方法为：
[0046](1)将所述的肽段与二甲基亚砜混合，得到浓度为8～12mg/mL的肽溶液；
[0047](2)将所述的肽溶液与Quick Switch
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种乙肝病毒特异性的肽段，其特征在于，所述肽段的序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种乙肝病毒特异性肽段的四聚体，其特征在于，包括权利要求1所述的肽段。3.根据权利要求2所述的四聚体，其特征在于，所述四聚体的制备方法为：(1)将权利要求1所述的肽段与二甲基亚砜混合，得到浓度为8～12mg/mL的肽溶液；(2)将所述的肽溶液与QuickSwitch
Tm
、肽交换因子混合，避光孵育3.5～4.5h，得到蛋白复合物；(3)将蛋白复合物与链霉亲和素
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藻红蛋白混合，得到四聚体。4.根据权利要求3所述的四聚体，其特征在于，所述肽溶液与Quick Switch
Tm
混合的体积比为1:45～55；所述肽溶液与肽交换因子混合液的体积比为1:1～2。5.根据权利要求4所述的四聚体，其特征在于，所述肽交换因子为叠氮钠缓冲液；所述叠氮钠缓冲液的浓度为0.06～0.08wt％。6.根据权利要求5所述的四聚体，其特征在于，所述蛋白复合物与链霉亲和素
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藻红蛋白混合的摩尔浓度比为4～5:1。7.一种检测乙肝病毒特异性CD8+T细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下组分：权利要求2～6任意一项所述的四聚体、96孔培养板、阴性对照、阳性对照、培养液、洗液、Percp
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Cy5.5标记的CD3、APC标记的CD8。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照的制备方法为：提取乙肝患者血液样品中的外周血单个核细胞，利用刺激剂2刺激所述的外周血单个核细胞，刺激培养至第3天加入白细胞介导素
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2，继续刺激培养3～5天，得到阴性...
【专利技术属性】
技术研发人员：范玉琛，王丽媛，杨雪彦，吴寅平，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：
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