一种新型冠状病毒中和活性纳米抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒中和活性纳米抗体，属于生物技术领域。本发明专利技术的纳米抗体包括纳米抗体B1

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒中和活性纳米抗体


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种新型冠状病毒中和活性纳米抗体。

技术介绍

[0002]导致新冠感染的病毒是新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)，这是一种有包膜的正链RNA新型冠状病毒，能够编码尖峰(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)结构蛋白、16种非结构蛋白和5
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8种辅助蛋白。病毒表面的S蛋白由1273个氨基酸组成，上面有一个弗林蛋白酶切割位点，弗林蛋白酶能够通过这个切割位点将S 蛋白切割成S1和S2两个亚单位。S1亚单位具有高度免疫原性，包含两个功能域，即受体结合域(RBD)和N末端域(NTD)。S1的结构域覆盖了S蛋白的上部，RBD位于尖端。RBD是病毒与靶细胞受体ACE2结合的重要位点，主要处于受体结合位点不可接近的“向下”构象，但它可以随机翻转，像铰链一样运动，短时转为“向上”构象时能够呈现ACE2受体结合位点。RBD作为抗原诱导产生的抗体具有良好的中和活性，目前已针对RBD研发了许多治疗药物、方法以及疫苗。但RBD作为中和抗体热点的同时也为病毒突变提供了大量机会。目前，出现了多种携带RBD突变的变异体，在奥密克戎毒株(B.1.1.529)上， RBD的变异位点就达到15个。这些变异体增加了新冠病毒的传播性或允许逃避抗体中和，导致大部分疫苗引发的抗体效力降低，或减弱了保护性中和抗体的效果。因此，为了对抗已经出现或即将出现的新冠变异株，急需一种针对保守表位的抗体来抵抗病毒变种，它应该能够识别S蛋白上高度保守的中和表位。
[0003]重链抗体存在于骆驼科物种中，是抗体的重链可变区，缺少常规抗体中出现的轻链和重链的第一个恒定区，所以大小通常只有12
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14kDa，尺寸在纳米范围内(直径约2.5纳米，高约4纳米)，也被称为纳米抗体。纳米抗体是保有常规抗体相当的抗原亲和力和特异性的最小单位，具有长于人类的互补决定区3 (CDR3)，能够形成指状结构穿透到抗原表面的空腔中，使得纳米抗体能够结合传统抗体通常无法接触到的抗原表位。并且纳米抗体可以在微生物原核表达系统中大量生产，运转周期短，且通常非常稳定，可以被雾化用于直接肺部递送，是开发替代给药途径的优秀候选者。现有技术从超嗜热菌分离的4
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二氧四氢喋啶合酶蛋白笼纳米颗粒(Aquifex aeolicus lumazine synthase,AaLS)(PDB ID： 1HQK)是一种开发递送、组装系统的一种具有潜力的蛋白质支架颗粒，可以作为支架来展示纳米抗体，提高纳米抗体的亲和力和中和活性。AaLS是一个由60 个相同的亚单位组成的内部中空十二面体，外径约为16纳米，内径约为8纳米，尺寸均匀、结构对称且具有热稳定性，Tm值约为120℃，并且由于AaLS中空的球形结构、良好的封装能力和呈现配体功能，AaLS的变体可以用于封装 RNA、蛋白质，也可以将小分子药物或者抗原抗体结合到AaLS的外表面从而递送到细胞中。为了把抗体连接到AaLS表面，我们改造了AaLS和纳米抗体，利用SpyCatcher003蛋白与其肽伴侣SpyTag003之间的自发形成异肽键将异质产生的抗体连接到AaLS支架上。SpyTag和SpyCatcher都可以位于蛋白质链的不同位置，在各种条件下(pH、缓冲液、温度)都能够反应。
[0004]尽管纳米抗体在生物医学研究中开辟了重要的可能性，但迄今为止，大部分的纳
米抗体都是通过免疫驼类动物而获得，其研发过程漫长且昂贵，对大多数实验室来说是一个巨大的门槛。天然纳米抗体库无需免疫动物，节约时间及成本，2
‑
3周可获得抗体序列，在筛选纳米抗体时表现出如下优势：(1)可以分离出多样性抗体单克隆；(2)可以分离出针对那些不引起机体免疫反应的弱抗原、自身抗原和具有毒性抗原的抗体；(3)可以用于多种抗原筛选而获得多种抗体产生；(4)在库容量足够大的时候可以获得高亲和力抗体。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型冠状病毒中和活性纳米抗体，本专利技术的纳米抗体具有分子量小、免疫原性小及稳定等特点，可以克服传统单克隆抗体无法在原核体系表达，研发周期长，生产成本高等劣势，该纳米抗体在治疗和预防新冠感染方面具有良好的发展前景。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种新型冠状病毒中和活性纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体B1
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4、纳米抗体C1
‑
5或者纳米抗体B
‑
B2 中的至少一种；所述纳米抗体B1
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4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述纳米抗体C1
‑
5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述纳米抗体B
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B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]本专利技术所采用的天然纳米抗体文库共采集103只成年健康羊驼血样，血液数量为2660ml，分离的PBMC细胞数目约1.06
×
10
10
，利用巢式PCR技术从分离的PBMC扩增整套抗体重链可变区基因，依据噬菌体展示技术，克隆至噬菌体载体pADL
‑
10b上，VHH以融合蛋白的形式表达在外壳表面。以噬菌体展示文库为流动相，SARS
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COV
‑
2受体结合域蛋白RBD作为靶点抗原，利用抗原
‑ꢀ
抗体特异性结合，通过孵育后洗去未结合的游离噬菌体，再洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染SS320感受态细胞后，经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过2
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3轮的“吸附
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洗脱
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扩增”后，即可得到与靶蛋白 SARS
‑
COV
‑2‑
RBD具有亲和性的纳米抗体。经过初筛后，对分离的抗体单克隆进一步用噬菌体ELISA进行特异性筛选，获取目的单克隆，经测序比对，将其命名为“B1
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4”、“C1
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5”和“B
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B2”，上述纳米抗体具有分子量小、免疫原性小及稳定等特点，可以克服传统单克隆抗体无法在原核体系表达，研发周期长，生产成本高等劣势，该纳米抗体在治疗和预防新冠感染方面具有良好的发展前景。
[0008]作为本专利技术所述的新型冠状病毒中和活性纳米抗体的优选实施方式，所述纳米抗体B1
‑
4的氨基酸公开序列如SEQ ID NO.4所示；所述纳米抗体C1
‑
5的氨基酸公开序列如SEQ ID NO.5所示；所述纳米抗体B
‑
B2的氨基酸公开序列如 SEQ ID NO.6所示。
[0009]作为本专利技术所述的新型冠状病毒中和活性纳米抗体的优选实施方式，所述纳米抗体包含互补决定区；所述互补决定区由CDR1、CDR2和CDR3组成。
[0010]作为本专利技术所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒中和活性纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括纳米抗体B1
‑
4、纳米抗体C1
‑
5或者纳米抗体B
‑
B2中的至少一种；所述纳米抗体B1
‑
4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述纳米抗体C1
‑
5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述纳米抗体B
‑
B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和活性纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体B1
‑
4的氨基酸公开序列如SEQ ID NO.4所示；所述纳米抗体C1
‑
5的氨基酸公开序列如SEQ ID NO.5所示；所述纳米抗体B
‑
B2的氨基酸公开序列如SEQ ID NO.6所示。3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和活性纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包含互补决定区；所述互补决定区由CDR1、CDR2和CDR3组成。4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和活性纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体B1
‑
4的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO.4自N端第30
‑
39位、第51
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63位和第10...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽良，陆玉瑛，陆家海，李芊璘，廖聪慧，张劲松，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：