一种调控丹参挥发性萜类化合物合成的MYC转录因子及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种调控丹参挥发性萜类化合物合成的MYC转录因子及其编码基因和应用。转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码转录因子的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术利用基因组及转录组数据，筛选、克隆丹参中的一个MYC转录因子，并通过实验验证了其与靶基因启动子的特定顺式作用原件结合，来激活靶基因的活性，从而调控萜类化合物的合成。成。成。

【技术实现步骤摘要】
一种调控丹参挥发性萜类化合物合成的MYC转录因子及其编码基因和应用


[0001]本专利技术涉及植物次生代谢
，尤其涉及一种调控丹参挥发性萜类化合物合成的MYC转录因子及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]丹参(Salvia miltiorrhiza)作为我国的传统中药，为唇形科鼠尾草属，以根和根茎入药。药理学研究表明丹参中丹参酮类和酚酸类化合物对于治疗心脑血管疾病具有显著疗效，作为重要的药用植物，其体内的挥发性萜类的研究较少，挥发性萜类普遍具有抗氧化和抗菌的功能，可保护植物免受病菌的侵害，同时挥发性萜类也可通过吸引害虫的天敌实现间接防御反应。
[0003]萜类化合物是植物次生代谢产生的一类天然产物，其合成途径有甲羟戊酸途径(mevalonate pathway,MVA)和2
‑
甲基赤藓糖醇
‑4‑
磷酸(2
‑
methyl
‑
D
‑
erythritol
‑4‑
phosphate pathway,MEP)两种。萜类合成酶肽链的长度通常有550
‑
850个氨基酸残基，倍半萜合酶肽链的长度为550
‑
580个氨基酸。按照萜类合成酶的结构与反应机制的不同，可分为Class I类和Class II类两类，I类酶的催化活性位点有α结构域，有两个高度保守的基序DDXXD和NSE/DTE，II类酶的活性位点有β结构域，含有1个保守基序DXDD。然而目前，还未有见研究调控丹参挥发性萜类化合物合成的转录因子的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的在于提供一种能够调控丹参挥发性萜类化合物合成的MYC转录因子及其编码基因和应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了一种调控丹参挥发性萜类化合物合成的MYC转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。以下记作转录因子SmMYC10。
[0006]本专利技术还提供一种编码上述MYC转录因子的基因，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。以下记作编码基因SmMYC10。
[0007]本专利技术还提供一种上述MYC转录因子的靶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。以下记作靶基因SmTPS1。
[0008]本专利技术还提供一种含有上述编码基因的过表达载体。
[0009]本专利技术还提供一种含有上述编码基因的干涉载体。
[0010]本专利技术还提供一种含有上述过表达载体或上述干涉载体的宿主菌。
[0011]本专利技术还提供一种含有上述靶基因的表达载体。
[0012]本专利技术还提供一种含有上述表达载体的宿主菌。
[0013]本专利技术还提供一种上述编码基因在调控丹参萜类化合物合成中的应用。
[0014]本专利技术还提供含有上述过表达载体或上述干涉载体的宿主菌瞬时侵染丹参花的方法，包括以下步骤：
[0015](1)将农杆菌在含有卡那和利福平的抗性板上进行划线，两天之后挑取单菌落去进行菌落PCR，将鉴定结果正确的菌液扩大培养，至OD
600
＝0.6
‑
0.8，在离心机中6000rpm离心10min收集菌体，弃掉上清，用加有乙酰丁香酮AS的侵染液去悬浮菌体，以备后续侵染；
[0016](2)使用蘸花法将丹参花在侵染液中蘸取1min30s，侵染后暗处理三天。
[0017]本专利技术的有益效果体现在：
[0018]本专利技术利用基因组及转录组数据，筛选、克隆丹参中的一个MYC转录因子，并通过实验验证了其与靶基因启动子的特定顺式作用原件结合，来激活靶基因的活性，从而调控萜类化合物的合成。本专利技术通过酵母单杂交和荧光素酶实验，证明SmMYC10可以与proSmTPS1互作，推测SmTPS1可能为SmMYC10的下游靶基因。对靶基因SmTPS1进行体外酶活分析，之后为了验证SmMYC10能否调控丹参SmTPS的表达，对丹参花进行瞬时表达SmMYC10
‑
OE和SmMYC10
‑
RNAi，采用GC
‑
MS测定它们与对照组中挥发性萜烯的含量变化。可见，该转录因子在丹参萜类化合物合成途径中具有广泛应用。
附图说明
[0019]图1为转录因子SmMYC与丹参萜类合成酶基因SmTPS1共表达网络图。
[0020]图2为编码基因SmMYC10琼脂糖凝胶电泳图。
[0021]图3为酵母单杂交验证转录因子SmMYC10与proSmTPS1互作。
[0022]图4为双荧光素酶实验验证转录因子SmMYC10与proSmTPS1互作(注：左边为实验组SmMYC10+proSmTPS1，右边为对照组EV+proSmTPS1)。
[0023]图5为SmTPS1染色体定位图。
[0024]图6为SmTPS1琼脂糖凝胶电泳图。
[0025]图7为SmTPS1体外酶活分析图。
[0026]图8为转录因子编码基因SmMYC10瞬时转化丹参花GC
‑
MS分析图。
具体实施方式
[0027]下面结合实施例对本专利技术作进一步描述，以下实施例所使用的各种原料和设备，如未作特别说明，均为本领域公知的市售产品。
[0028]实施例1
[0029]丹参SmMYC基因的筛选及编码基因SmMYC10全长cDNA的扩增
[0030]取盛花期的丹参花朵送诺禾致源公司进行转录组测序，根据前期所筛选到的丹参中的SmMYC基因和SmTPS基因以及转录组中所提供的丹参各个基因的表达量，构建了丹参SmMYC转录因子与萜类合成酶基因SmTPS1的共表达网络图，筛选到转录因子SmMYC10与萜类合成酶基因SmTPS1相关性较高。
[0031]使用植物RNA提取试剂盒提取紫花丹参总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，使用分光光度计测定总RNAOD260/280检测RNA质量。按照逆转录试剂盒说明书，以提取的丹参总RNA为模板，逆转录合成得到cDNA。。
[0032]以丹参cDNA为模板，根据SmMYC10的CDS序列通过Primer Premier 5软件设计特异性引物，交由上海生工生物工程股份有限公司进行引物合成，之后通过PCR扩增，克隆得到目的基因。具体步骤如下：
[0033]以所提取的RNA为模板，采用两步法反转录成cDNA：
[0034]第一步：基因组DNA去除污染，反应体系如下表1所示：
[0035]表1
[0036][0037]PCR反应条件如下：37℃温浴2min；55℃温浴5min；4℃2min。
[0038]第二步：cDNA合成，反应体系如下表2所示：
[0039]表2
[0040][0041]PCR反应条件如下：50℃温浴15min：85℃温浴5min；4℃2min。反应结束后将反转录产物放
‑
40℃保存。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控丹参挥发性萜类化合物合成的MYC转录因子，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码如权利要求1所述的MYC转录因子的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种如权利要求1所述的MYC转录因子的靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.一种含有如权利要求2所述的基因的过表达载体。5.一种含有如权利要求2所述的基因的干涉载体。6.一种含有如权利要求4所述的过表达载体或权利要求5所述的干涉载体的宿主菌。7.一种含有如权利要求3所述的靶基因的表达载体。8.一种含有如权利要求7所述的表...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊洪泓，李晓红，孙旭，刘林，蔡永萍，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：