枇杷EjGASA6基因及其编码的蛋白与应用制造技术

本发明专利技术涉及植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷赤霉素相关EjGASA6基因及其编码的蛋白质和应用。该基因的cDNA序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列，如SEQ IDNo.2所示。本发明专利技术所述的EjGASA6基因通过增强赤霉素生物合成促进植物生长发育。采用根癌农杆菌Gv3101介导的浸花法将含目的基因的植物表达载体pLGN

【技术实现步骤摘要】
枇杷EjGASA6基因及其编码的蛋白与应用


[0001]本专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷EjGASA6基因、其编码的蛋白和应用。

技术介绍

[0002]枇杷(Eriobotrya japonica)是蔷薇科枇杷属亚热带常绿果树，其果实成熟于春末夏初的水果淡季，以其较高的食用及药用价值受到越来越多的青睐，赤霉素在枇杷优良品种选育进程中提升枇杷无核或少核化枇上取得良好成效，但其中分子生理机制尚待深究，因此研究赤霉素代谢相关基因在枇杷中的生理生化作用就十分重要，本研究为阐明GASA蛋白在枇杷赤霉素信号途径中的作用及其在枇杷发育中的生物学功能研究提供线索和依据。
[0003]GASA(Gibberellic Acid
‑
Stimulated in Arabidopsis)蛋白(又称Snakin蛋白)是一类广泛受赤霉毒调控的小分子蛋白。现有研究表明GASA蛋白在植物生长发育以及胁迫响应中广泛发挥功能，如防御病原及线虫，调节花冠伸长、器官形成、果实成熟、茎干生长和开花时间，响应高温胁迫等。尽管赤霉素信号通路已经大致阐明，但GASA基因家族在赤霉素信号途径中的作用机制还知之甚少，以及这些基因编码的蛋白质在植物尤其是木本植物生长发育以及胁迫响应中的相关作用机制尚不清。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种枇杷EjGASA6蛋白及其编码基因和应用。
[0005]首先，本专利技术提供枇杷EjGASA6蛋白，其为：
[0006]1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或
[0007]2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
[0008]本专利技术还提供编码所述的枇杷EjGASA6蛋白的基因。
[0009]优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。
[0010]本专利技术还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。
[0011]本专利技术还提供所述基因在促进植物赤霉素生物合成中的用途。
[0012]在本专利技术一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，通过增强赤霉素生物合成进而促进植物生长发育。
[0013]在本专利技术一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，通过增强赤霉素生物合成进而促进植物提前开花。
[0014]本专利技术从枇杷中分离了1个拟南芥AtGASA6同源的EjGASA6蛋白，其广泛定位于核膜、内质网膜、细胞膜。利用基因工程的手段构建了EjGASA6基因的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中使其超量表达，证实了过表达EjGASA6能够增强拟南芥赤霉素生物合成，进而促进植物生长发育和提前开花。本专利技术为植物内源赤霉素含量的改造提供了很好的应
用前景。
附图说明
[0015]图1所示是枇杷EjGASA6基因的克隆电泳照片。其中，M为DL2000 DNA marker，1为EjGASA6基因ORF的PCR产物。
[0016]图2所示是枇杷EjGASA6编码蛋白质的氨基酸序列与苹果、拟南芥的序列对比，均具有高度保守的GASA结构域。
[0017]图3所示是枇杷EjGASA6基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，表明EjGASA6蛋白定位于核膜、内质网膜、细胞膜。GFP：绿色荧光蛋白；RFP：红色荧光蛋白；BF：明场成像；Merged：GFP，RFP和BF的合并后的图像。
[0018]图4是枇杷EjGASA6转基因拟南芥阳性鉴定。(A)GUS染色鉴定；(B
‑
C)PCR扩增鉴定。M:DL2000 DNA marker；P:阳性对照；N:阴性对照；(D)RT
‑
qPCR鉴定。
[0019]图5所示是EjGASA6转基因拟南芥表型变化。(A)植株生长表型差异；(B
‑
C)垂直培养后根生长差异；(D
‑
E)暗培养后下胚轴生长差异。
[0020]图6所示是EjGASA6转基因前后的拟南芥内源活性赤霉素(GA1、GA3、GA4、GA7)含量测定。
具体实施方式
[0021]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0022]实施例1枇杷EjGASA6基因cDNA序列的克隆及表达载体构建
[0023]本研究所用试材取自西南大学果树学重点实验室多倍体枇杷资源圃中的“龙泉1号”枇杷的花蕾。取样后，放入冻存管中，放入液氮中速冻2h后，然后放入
‑
80℃超低温冰箱中待用，采用RNA提取试剂盒提取枇杷花蕾中的总RNA。。
[0024]基于本团队前期的枇杷花器官的转录组测序数据，在枇杷EjGASA6基因编码区序列全长两端设计同源重组引物。其中正向引物为EjGASA6
‑
F(5
′‑
tacggatccgtactagtcccAAAGAGGCAATGGCAATG GC
‑3′
)，反向引物为EjGASA6
‑
R(5
′‑
ggtaccatgtcgacgggcccGATCAAG GGCATTTTGGTCC
‑3′
)。
[0025]以枇杷花蕾cDNA为模板对EjGASA6基因编码区cDNA序列进行扩增。PCR扩增体系及反应条件如下：总体积20μL，模板1μL，上下游引物(10μmol/L)均为1μL，2
×
PrimerSTAR MAX Premix10μL，无菌ddH2O 7μL；扩增程序为95℃预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，重组到用限制性内切酶SmaI线性化后的pLGN
‑
35S
‑
MCS
‑
Nos
‑
BE载体上，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对EjGASA6基因的编码区序列进行验证，获得植物转基因表达载体pLGN
‑
35S
‑
EjGASA6
‑
NOS
‑
BE。
[0026]使用DNAMAN软件对编码区序列验证实验的PCR测序结果，进行序列拼接分析，得到枇杷EjGASA6基因cDNA的编码区序列(SEQ ID No.1)。
[0027]使用DNAMAN软件，对枇杷EjAGL6基因的cDNA的编码区序列进行蛋白质序列翻译
(SEQ ID No.2)。进一步，将枇杷EjGASA6基因编码蛋白质的氨基酸序列与苹果拟南芥的GASA6蛋白进行氨基酸的特异性分析，发现这些序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.枇杷EjGASA6蛋白，其为：1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述的枇杷EjGASA6蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。4.含有权利要求2或3所述基因的载体。5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：郭启高，陈倩，雍顺圆，傅豪，梁国鲁，何桥，党江波，罗明，景丹龙，徐凡，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：