一种高产L-苏氨酸的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产L

【技术实现步骤摘要】
一种高产L
‑
苏氨酸的基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物应用
，尤其涉及一种高产L
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苏氨酸的基因工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]L
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苏氨酸，又名L
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羟基丁氨酸，是一种重要的营养强化剂，因此被广泛应用于食品、医药和饲料行业。L
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苏氨酸可以强化谷物、糕点、乳制品，和色氨酸一样有恢复人体疲劳，促进生长发育的效果。医药上，由于苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。L
‑
苏氨酸也是动物本身不能合成，但又十分需要的氨基酸，能用来精确平衡饲料的氨基酸组成，满足动物生长维持需要，提高增重和瘦肉率，因此常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。
[0003]发酵法生产L
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苏氨酸的方法，有使用大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、产谷氨酸小球菌、黄色短杆菌等菌株，以葡萄糖、氨等原料发酵生产后，再经过精制而成。需钠弧菌是一种革兰氏阴性、对人类非致病的海洋细菌。其倍增时间在7～10分钟之间，传代速度比大肠杆菌快一倍，是已知代时最短的自由生活细菌。需钠弧菌与大肠杆菌相比，有相似的功能元件和培养条件，或可称为大肠杆菌有潜力的替代宿主。需钠弧菌的高生长和高底物摄取速率在发酵应用时，有望在前期快速生长，缩短发酵延滞期，在工业生产中节约能量和时间成本。需钠弧菌作为一个新型微生物底盘，到目前为止，尚不知需钠弧菌生产L
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苏氨酸的能力。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种高产L
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苏氨酸的基因工程菌及其应用，该基因工程菌能够高产L
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苏氨酸，具有潜在商业应用前景。
[0005]具体技术方案如下：
[0006]本专利技术公开了一种基因工程菌，包括宿主细胞以及在宿主细胞中表达且自我复制的重组质粒，所述宿主细胞为需钠弧菌(Vibrio natriegens)ATCC14048，宿主细胞基因组中的TDH基因、THRL基因被敲除，THRA基因的第433位甘氨酸突变为精氨酸；所述TDH基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；THRL基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；THRA基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；所述重组质粒包含有RHTC基因；所述RHTC基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]其中，需钠弧菌(Vibrio natriegens)ATCC14048为已有市售产品，可购于美国组织培养库(ATCC)。
[0008]进一步地，所述重组质粒的原始表达载体为pSU2718。
[0009]进一步地，原始表达载体中，所述RHTC基因的上游启动子为lac启动子，碱基序列如SEQ ID NO.5所示。
[0010]本专利技术提供了如上所述的基因工程菌在高产L
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苏氨酸中的应用。
[0011]进一步地，所述的应用，包括：将如权利要求1～3任一项所述的基因工程菌接至发酵培养基中，进行发酵培养，得到富含L
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苏氨酸的发酵产物。
[0012]进一步地，所述发酵培养基为：硫酸铵20～25g/L、磷酸氢二钾1～3g/L、酵母提取物0.5～1.5g/L、氯化钠10～20g/L、七水合硫酸镁0.5～1g/L、葡萄糖25～35g/L、五水合硫酸锰0.01～0.03g/L、七水合硫酸亚铁0.01～0.03g/L、硫胺素1～3mg/L。
[0013]进一步地，以质量分数计，所述基因工程菌的接种量为1～2％。
[0014]进一步地，所述发酵培养的温度为30℃；时间为12小时。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0016]本专利技术通过天然转化的基因编辑方法实现了2个基因的敲除和1个基因的点突变，并通过质粒过表达1个外源基因，首次构建获得能通过发酵法生产L
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苏氨酸的需钠弧菌，该工程菌生长周期短，能快速利用葡萄糖将其转化为L
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苏氨酸，并将L
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苏氨酸分泌到胞外，分离纯化简单，无需细胞破碎，摇瓶发酵产量达到1.1g/L。
附图说明
[0017]图1为实施例1中构建的rhtC基因表达质粒图谱。
[0018]图2为实施例2中构建的需钠弧菌生产L
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苏氨酸产量柱状图；
[0019]其中，ATCC表示需钠弧菌野生型；ATCC
△
tdh表示敲除TDH基因的需钠弧菌；ATCC
△
thrL表示敲除THRL基因的需钠弧菌；ATCC
△
thr A*表示THRA基因的第433位甘氨酸突变为精氨酸的需钠弧菌；ATCC
△
tdh
△
thrLthrA*表示敲除TDH基因、敲除THRL基因、THRA基因的第433位甘氨酸突变为精氨酸的需钠弧菌；Threonine表示L
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苏氨酸；Lactate表示乳酸；Formic acid表示甲酸；Acetate表示乙酸。
[0020]图3为实施例3中构建的不同RHTC表达形式的需钠弧菌生产L
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苏氨酸产量柱状图；
[0021]其中，Threonine表示L
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苏氨酸；natural promoter表示用从大肠杆菌克隆的天然启动子表达RHTC；genome integrated
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rhtC表示将RHTC天然启动子表达盒整合到需钠弧菌基因组上；pBAD
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rhtC表示用阿拉伯糖诱导型启动子表达RHTC；pTac
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rhtC表示用tac启动子表达RHTC；pLac
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rhtC表示用lac启动子表达RHTC；p J23119
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rhtC表示用J23119启动子表达RHTC；pTet
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rhtC表示用脱水四环素诱导型启动子表达RHTC。
具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述，以下列举的仅是本专利技术的具体实施例，但本专利技术的保护范围不仅限于此。
[0023]实施例1 tdh基因敲除
[0024]运用天然转化和同源重组技术对需钠弧菌(Vibrio natriegens)ATCC14048菌株进行基因敲除和点突变。
[0025]需钠弧菌(Vibrio natriegens)ATCC14048购于美国组织培养库(ATCC)。
[0026]具体步骤包括：
[0027]1.tdh基因敲除修复模板构建
[0028]以需钠弧菌基因组DNA为模板，分别采用引物对tdh
‑
u
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F和tdh
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u
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，包括宿主细胞以及在宿主细胞中表达且自我复制的重组质粒，其特征在于，所述宿主细胞为需钠弧菌(Vibrio natriegens)ATCC14048，宿主细胞基因组中的TDH基因、THRL基因被敲除，THRA基因的第433位甘氨酸突变为精氨酸；所述TDH基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；THRL基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；THRA基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；所述重组质粒包含有RHTC基因；所述RHTC基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组质粒的原始表达载体为pSU2718。3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，原始表达载体中，所述RHTC基因的上游启动子为lac启动子，碱基序列如SEQ ID NO.5所示。4.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐佳琪，蒋宇，孙兵兵，杨晟，杨立荣，吴坚平，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：