血浆中阿比特龙的定量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种血浆中阿比特龙的定量测定方法，属于阿比特龙定量检测方法技术领域，本方法首先制备阿比特龙的校正标样、质控样品、零浓度血浆样品；然后制备校正标样工作液、质控样品工作液、待测样品工作液、零浓度血浆样品工作液，以及空白血浆样品工作液和空白试剂样品工作液；再用空白血浆样品工作液和空白试剂样品进行液相色谱

【技术实现步骤摘要】
血浆中阿比特龙的定量测定方法


[0001]本专利技术属于药物检测领域，特别是血浆中阿比特龙的定量测定方法。

技术介绍

[0002]阿比特龙(ABTL)为CYP17抑制剂，临床上以醋酸阿比特龙(阿比特龙乙酰酯)，且与泼尼松联用，主要治疗既往接受含多烯紫杉醇化疗转移去势难治性前列腺癌患者。目前，阿比特龙的不良反应包括：心血管疾病史高血压、低血钾症、由于盐皮质激素过量液体潴留，肾上腺素皮质功能不全，肝毒性等。此外食物对醋酸阿比特龙的吸收有显著影响；且阿比特龙在肝损患者中应根据阿比特龙暴露量进行个体化给药，同时阿比特龙血浆蛋白结合率高，可能会置换其它蛋白结合药物。
[0003]目前，国内关于阿比特龙在犬血浆中检测方法的报道较少，多数集中于临床样品检测。而犬类作为制剂开发的主要试验动物种属，常常用于阿比特龙的制剂开发。
[0004]例如中国授权专利CN107014915B提供了全血中阿比特龙的定量检测方法，通过先在全血裂解液中加入乙酸乙酯，离心取上清液，氮气吹干后用乙腈水溶液复溶、离心取上清液；另取碱性硅藻土在玻璃层析柱中振动处理，再将上清液加至玻璃层析柱中先后用纯水、甲醇水溶液、色谱甲醇洗脱，收集洗脱液氮气吹干，用乙腈水溶液复溶、离心；再取上清液过色谱柱进行检测。该方法试验操作复杂，耗时非常长。
[0005]例如中国专利申请CN112379026A公开了一种定量测定血液中阿比特龙的方法，通过在犬血浆样品中加入内标工作液，利用色谱和质谱联用的方法，得到色谱图和质谱图，进而根据阿比特龙的标准曲线得出血液样品中阿比特龙的含量。
[0006]例如中国专利申请CN112198244A同样公开了一种测定血浆中阿比特龙浓度的方法，先制备标准系列的阿比特龙工作溶液，然后将阿比特龙工作溶液稀释到空白血浆中配制成阿比特龙标准曲线血浆样品，制定标准曲线方程，计算色谱提中色谱峰面积和内标峰面积计算阿比特龙的浓度。然而，该方法采用的色谱柱成本非常高；其标准曲线1
‑
500ng/mL，检测限较高；处理时间虽然较短，但是样品用量大，离心时间过长，直接取上清进样对仪器损伤大；仅仅适用于单个样品且需要6min，面对大通量(例如96孔板)时不适用；流动相A中含有盐，耗时长，大量检测样本时对质谱有一定的损伤。

技术实现思路

[0007]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了血浆中阿比特龙的定量测定方法，具体通过以下技术实现。
[0008]血浆中阿比特龙的定量测定方法，包括以下步骤：
[0009]S1、制备阿比特龙的校正标样和质控样品；
[0010]S2、取步骤S1制备的校正标样、质控样品、待测样品各50μL；零浓度血浆样品取空白血浆50μL分别加至EP管(1.5mL EP管)中，所述校正标样、质控样品、待测样品及零浓度血浆样品的EP管中各自加入20μL内标工作液和200μL乙腈，涡旋混合；分别在4℃， 10000g条
件下离心5min；各自取100μL的上清液加入含有100μL 0.1％甲酸水溶液的96 孔板中进行复溶，涡旋混合5min，制成校正标样工作液、质控样品工作液、待测样品工作液、零浓度血浆样品工作液，待用；在进样分析前，一般将这些工作液保存在自动进样器或0～10℃的冰箱中；
[0011]S3、取空白血浆样品50μL加至EP管中并加入20μL体积比为1:1的甲醇水溶液；取蒸馏水50μL加至EP管中并加入20μL体积比为1:1的甲醇水溶液，分别加入200μL的乙腈，分别在4℃，10000g条件下离心5min；各自取100μL的上清液加至孔板中，所述孔板的每个孔中加入复溶液复溶，涡旋混合5min，制成空白血浆样品工作液和空白试剂样品工作液，待用；在进样分析前，一般将这些工作液保存在自动进样器或0～10℃的冰箱中；
[0012]S4、以步骤S3制备的空白血浆样品工作液、空白试剂样品工作液和步骤S2制备的零浓度血浆样品工作液对液相色谱
‑
质谱系统进行测试；
[0013]S5、以步骤S2制备的校正标样工作液、质控样品工作液和待测样品工作液分别进行液相色谱
‑
质谱分析，建立阿比特龙标准曲线，计算得到待测样品工作液中阿比特龙的含量。
[0014]相比于
技术介绍
中现有的血浆中阿比特龙浓度的定量检测方法，本专利技术的上述方法适用于高通量的阿比特龙的定量检测，检测时间短，检测限更低，检测精度更高，成本较低，可在短时间内大批量检测该分析物的血浆样本。
[0015]通过采用本专利技术提供的上述方法，对分析物和内标的色谱图采集和色谱峰积分由分析软件Analyst 1.6.3(AB Sciex)进行处理，在优化积分参数后，对目标色谱峰自动积分，不允许对色谱峰进行单独积分或手动积分。
[0016]分析物浓度计算方法为：用软件Analyst 1.6.3分别获得分析物与内标工作液中的甲苯磺丁脲的色谱峰面积，采用加权(W＝1/x2)最小二乘法以血浆中分析物浓度(X)与峰面积比(Y)进行线性回归，所得的回归方程(Y＝a+bX)即为标准曲线。根据分析批的标准曲线计算血浆中分析物的浓度，浓度单位为ng/mL。
[0017]优选地，步骤S1中，阿比特龙的校正标样和质控样品的制备方法为：精密称取一定量的阿比特龙，重量经校正因子计算后，加入甲醇配制成浓度为1mg/mL的溶液；再用体积比为1:1的甲醇水溶液依次稀释成浓度为10000ng/mL、8000ng/mL、5000ng/mL、 1000ng/mL、200ng/mL、80ng/mL、20ng/mL、10ng/mL的校正标样储备液，以及浓度为 6000ng/mL、600ng/mL、30ng/mL的质控样品储备液；最后各取校正标样储备液和质控样品储备液10μL，加入190μL的犬的空白血浆样品，得到校正标样和质控样品；
[0018]步骤S2的所述零浓度样品是由50μL空白血浆样品、20μL内标工作液和200μL的乙腈涡旋混合而成。
[0019]采用上述方法制得的校正标样的阿比特龙浓度为0.5ng/mL、1ng/mL、4ng/mL、 10ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、400ng/mL、500ng/mL；制得的质控样品的阿比特龙浓度为1.5ng/mL、3ng/mL、30ng/mL。
[0020]优选地，步骤S2中，所述内标工作液是浓度为1000ng/mL甲苯磺丁脲溶液。甲苯磺丁脲溶液采用体积比为1:1的甲醇水溶液为溶剂配制而成。
[0021]优选地，步骤S4和S5中的液相色谱的条件为：色谱柱Venusil C18 Plus，2.1
×
50mm， 5.0μm；流动相A为质量分数为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；自动进样器清洗溶
液为甲醇，柱温35℃，流速0.6mL/min，色谱柱平衡状态时的柱压为12.6MPa，自动进样器温度为8℃，进样体积为2μL，压脚提升量为50mm；自动进样器清洗模式为进样前后，清洗液洗针体积为200μL，自动进样器本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.血浆中阿比特龙的定量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备阿比特龙的校正标样和质控样品；S2、取步骤S1制备的校正标样、质控样品、待测样品各50μL；零浓度血浆样品取空白血浆50μL分别加至EP管中，所述校正标样、质控样品、待测样品及零浓度血浆样品的EP管中各自加入20μL内标工作液和200μL乙腈，涡旋混合；分别在4℃，10000g条件下离心5min；各自取100μL的上清液加入含有100μL 0.1％甲酸水溶液的96孔板中进行复溶，涡旋混合5min，制成校正标样工作液、质控样品工作液、待测样品工作液、零浓度血浆样品工作液，待用；S3、取空白血浆样品50μL加至EP管中并加入20μL体积比为1:1的甲醇水溶液；取蒸馏水50μL加至EP管中并加入20μL体积比为1:1的甲醇水溶液，分别加入200μL的乙腈，分别在4℃，10000g条件下离心5min；各自取100μL的上清液加至孔板中，所述孔板的每个孔中加入复溶液复溶，涡旋混合5min，制成空白血浆样品工作液和空白试剂样品工作液，待用；S4、以步骤S3制备的空白血浆样品工作液、空白试剂样品工作液和零浓度血浆样品工作液对液相色谱
‑
质谱系统进行测试；S5、以步骤S2制备的校正标样工作液、质控样品工作液和待测样品工作液分别进行液相色谱
‑
质谱分析，建立阿比特龙标准曲线，计算得到待测样品工作液中阿比特龙的含量。2.根据权利要求1所述的血浆中阿比特龙的定量测定方法，其特征在于，步骤S1中，阿比特龙的校正标样和质控样品的制备方法为：精密称取一定量的阿比特龙，重量经校正因子计算后，加入甲醇配制成浓度为1mg/mL的溶液；再用体积比为1:1的甲醇水溶液依次稀释成浓度为10000ng/mL、8000ng/mL、5000ng/mL、1000ng/...

【专利技术属性】
技术研发人员：李盈，吴琳，郏自明，胡汉高，
申请(专利权)人：湖北省疾病预防控制中心湖北省预防医学科学院，
类型：发明
国别省市：