基于核酸外切酶Ⅲ的荧光分析法检测黄曲霉毒素的方法技术

本发明专利技术公开了基于核酸外切酶Ⅲ的荧光分析法检测黄曲霉毒素的方法，包括步骤：(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段；(2)核酸外切酶Ⅲ对DNA的剪切；(3)AFB1浓度测定：加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR，测定检测样品AFB1浓度下扩增曲线，根据线性方程确定AFB1浓度，线性方程为y＝5.72+1.0415lgC，C代表AFB1的浓度，其中一元线性回归判定系数R2＝0.99，线性范围0.03

【技术实现步骤摘要】
基于核酸外切酶Ⅲ的荧光分析法检测黄曲霉毒素的方法


[0001]本专利技术涉及一种基于核酸外切酶Ⅲ的荧光分析法检测黄曲霉毒素的方法，用于检测黄曲霉毒素B1，属于分析化学
和食品安全


技术介绍

[0002]黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是由黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的次级产物，毒性极强，被世界卫生组织的癌症研究机构划分为Ⅰ类致癌物。AFB1具有致突变性﹑致畸性和致癌性，可在采摘前﹑收获后储存﹑运输和食用等不同阶段对农产品、食品及中药材等产生污染,威胁人类健康。因此进一步对AFB1进行监测极其重要。
[0003]长期以来，科研工作者为AFB1的检测探索了许多方法,如薄层色谱法高效液相色谱法(HPLC)胶体金免疫层析技术(GICT)、液质联用(LCMS)和酶联免疫吸附法(ELISA)。高效液相色谱法是检测真菌毒素最常用的检测技术,现有的真菌毒素检测方法大多依赖于大型仪器，并且需要复杂的样品处理过程，这些方法虽具有很高的特异性和灵敏度，但普遍存在样品前处理步骤复杂繁琐，耗时长，不适合现场操作等不足之处。研发快本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于核酸外切酶Ⅲ的荧光分析法检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段：设计一段能够对AFB1特异性识别的DNA片段及其互补DNA片段，根据此序列来设计实时荧光定量PCR用的上下游引物；(2)核酸外切酶Ⅲ对DNA的剪切：把模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris
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HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，加入检测样品，然后混合液在恒温金属浴中37℃下处理30min，加入适量的核酸外切酶Ⅲ后反应90s，核酸外切酶Ⅲ把与互补DNA互补配对的模板DNA沿着3'
→
5'的方向逐步切去单核苷酸片段切断；随后整个体系在恒温金属浴中98℃反应10min，让核酸外切酶Ⅲ失活，结束核酸外切酶Ⅲ对模板DNA的剪切；(3)AFB1浓度测定：加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR，测定检测样品AFB1浓度下扩增曲线，根据线性方程确定AFB1浓度，线性方程为y＝5.72+1.0415lgC，C代表AFB1的浓度，其中一元线性回归判定系数R2＝0.99，线性范围0.03
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10nM，检测限为0.02nM，信噪比等于3。2.根据权利要求1所述的基于核酸外切酶Ⅲ的荧光分析法检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于：模板DNA：5
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AATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTTAGCGCCGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTCTCTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA
‑3’
互补DNA：5
’‑
TGTGGGCCTAGCGAAGGGCACGAGAGAGAGAGAGACAACACGTGCCCAACGGCGCTAAGAAACATCGCCACGGGGAAGGCGTACTCGCG
‑3’
上游引物：...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱颖越，陈静怡，李瀚阳，李欣怡，周旋，储呈娴，王悦蔓，潘妙婷，
申请(专利权)人：常熟理工学院，
类型：发明
国别省市：