本发明专利技术提供了一种用于核酸原位合成的固相载体的制备方法，该制备方法通过活化固相基底材料，再利用末端为疏水性官能团的长链试剂和带有氨基基团的长链试剂混合配比，通过分子间的脱水缩合作用实现活性官能团与疏水性官能团的混合接枝，然后将带有保护基的可裂解连接物连接至接枝的固相载体上从而形成固相载体，由此，提供了一套可以高效原位合成核酸的反应体系，从而实现核酸的高效合成。从而实现核酸的高效合成。从而实现核酸的高效合成。
【技术实现步骤摘要】
一种用于原位合成核酸的固相载体的制备方法与应用
[0001]本专利技术属于寡核苷酸原位合成
，更具体的，本专利技术涉及用于寡核苷酸原位合成的固相载体的制备技术。
技术介绍
[0002]目前，商业化的寡核苷酸合成仪为柱式合成仪，此种仪器合成方法是将商品化的固相无机颗粒载体，例如CPG载体，填充于反应柱中，然后进行自动化合成。随着对原位合成核酸序列的需要，此种寡核苷酸的柱式合成仪的缺点也越来越凸显，寡核苷酸柱式合成仪主要存在两方面问题：一是由于填充柱的局限性导致了合成仪的通量较小，单位时间内合成寡核苷酸序列种类比较少，已经不能满足目前的市场需求；另一方面是由于现有固相载体CPG制备技术的缺陷导致。
[0003]现阶段商品化的CPG载体主要有三部分组成：一是固相基底材料多孔玻璃；二是用于核酸起始步骤合成的带有羟基保护基的可裂解连接物，可以是带有羟基保护基的单体或其它通用结构载体等；三是用于连接固相基底和可裂解连接物的接头，如：丁二酸酐等。由于目前商品化的CPG仅在多孔玻璃上实现，受多孔玻璃本身对核酸的吸附作用影响，利用现有的商品化CPG在核酸合成过程中，存在核酸合成链越长，核酸合成能力降低的缺陷虽然现专利CN110511973A中公开了一种用于核酸原位合成的固相载体及其制备方法，其所制备的载体的载量虽然相比于市面上CPG载体的载量较高，但是其载量仍然需要进一步的提高。
技术实现思路
[0004]针对上述问题本专利技术提供了一种新型疏水性官能团与功能化官能团混合接枝方式连接固相基底材料和可裂解连接物，通过对试剂用量的优化能够有效提高CPG载体载量以及核酸产物的纯度，且本专利技术的新连接方法不限于仅用多孔玻璃作为固相载体的制备基底材料，其固相基底材料可以为多孔玻璃、玻片，也可以为聚苯乙烯微球、磁性颗粒、陶瓷、有机玻璃等材质作为固相基底。另外本专利技术还可应用于未来基于片基固相基底研发的高通量核酸合成仪的开发应用。
[0005]本专利技术的目的在于克服现有原位合成核酸技术中，固相载体制备技术存在核酸合成链越长，核酸合成能力降低、合成产物纯度降低的缺陷。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种新型用于核酸原位合成的固相载体制备技术，利用一种新的疏水性官能团与功能化官能团混合接枝方式，可连接多种固相基底和用于核酸起始步骤合成的可裂解连接物，可以有效选择多种固相基底材料，进而可选择性的优化提高核酸原位合成的效率和核酸产物的纯度。
[0008]本专利技术用于核酸原位合成固相载体的制备路线包括：活化固相基底材料，疏水性官能团混合接枝，将带有保护基的可裂解连接物连接至接枝的固相载体上
。
[0009]优选的，所述活化固相基底材料是将固相基底材料羟基化。
[0010]优选的，所述固相基底材料为玻璃、石英、陶瓷、聚苯乙烯以及硅材质的片基或微球，多孔微珠以及磁性Fe3O4颗粒作为基底材料。
[0011]优选的，所述固相基底材料的形状不受特别限定。
[0012]优选的，所述固相基底材料的形状是片基、微球状和多孔微珠中的一种或多种。
[0013]优选的，所述羟基化的方法包括食人鱼溶液，浓碱溶液，等离子清洗活化。
[0014]优选的，所述疏水性官能团混合接枝使用的是疏水性试剂与氨基硅烷偶联剂，配比为1～1：10。
[0015]优选的，所述疏水性试剂包括氟硅烷偶联剂，烷基硅烷偶联剂，苯基硅烷偶联剂。
[0016]优选的，所述疏水性官能团包括
‑
CH3和/或
‑
F。
[0017]优选的，所述固相基底材料为片基时，相对于单位面积所需的混合接枝试剂浓度为0.1％
‑
30％，更优选浓度为1％
‑
5％。
[0018]优选的，所述固相基底材料为微球或微珠时，大小为1μm
‑
1000μm，更优选大小为50μm
‑
150μm。
[0019]优选的，所述固相基底材料为多孔微珠时，多孔微珠的孔径大小为更优选大小为
[0020]优选的，所述固相基底材料为多孔微珠时，相对于多孔微珠的用量来说，所述接枝试剂用量为100μmol/g
‑
100mmol/g，更优选的用量为500μmol/g
‑
5mmol/g。
[0021]优选的，所述可裂解连接物包括核苷羟基连接物，具有以下结构式：
[0022][0023]上式中R3表示的基团包括碱基和通过保护基来保护氨基的碱基；
[0024]R4表示的基团包括氢原子、羟基、卤素原子、具有1
‑
20个碳原子的烷氧基和被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基。
[0025]优选的，所述碱基包括核酸碱基，所述保护基包括氨基乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基。
[0026]另一方面，本专利技术还提供了一种高效原位合成核酸的反应体系。通过对上述方法制备的固相载体表面载量进行优化，得到一套可以高效原位合成核酸的反应体系。
[0027]所述固相载体的可裂解连接物的负载量为1
‑
150μmol/g；优选1
‑
100μmol/g。
[0028]另一方面，本专利技术还提供了一种寡核苷酸合成的固相载体的应用，所述固相载体用于核酸合成起始步骤，在接头修饰载体上负载有可裂解连接物，该可裂解连接物是作为核酸合成反应的起点化合物，其在加热及碱性等条件下可裂解，用来从接头修饰载体上切割合成的核酸。
[0029]所述固相载体的应用是在缩合剂的存在下通过脱水缩合反应将可裂解的连接物与固相载体共价键合。
[0030]优选的，所述脱水缩合反应在对反应惰性的溶剂中进行，所述包括卤化烃溶剂、芳香族溶剂、脂族烃类溶剂，腈溶剂。
[0031]优选的，所述溶剂为芳香族溶剂吡啶。
[0032]优选的，所述缩合剂包括二环己基碳二亚胺(DCC)、4
‑
二甲氨基吡啶(DMAP)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、N
‑
乙基
‑
N'
‑3‑
二甲基氨基丙基碳二亚胺或其盐酸盐(EDC
·
HCl)。
[0033]更优选的，所述缩合剂为二环己基碳二亚胺(DCC)和4
‑
二甲氨基吡啶(DMAP)。
[0034]本专利技术的有益效果：
[0035](1)本专利技术通过对固相基底表面采用疏水官能团与亲水官能团的混合改性，并且改进固相基底与连接单体之间的新方法的接枝，进而可以选择多种材质作为固相基底材料，从而可选择性的优化提高核酸原位合成效率和纯度。
[0036](2)本专利技术所用的接头试剂为疏水性修饰试剂和功能化修饰试剂，通过对固相基底材料的表面官能团混合修饰，从而降低了固相基底材料表面分子间的电子干扰效应以及降低化学反应的空间位阻效应，从而通过对试剂用量的优化达到了优于商品化CPG载体的核本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于原位合成核酸的固相载体的制备方法，其特征在于，所述固相载体的制备步骤包括：羟基化固相基底材料，疏水性官能团与功能化官能团的混合接枝，将带有保护基的可裂解连接物连接至接枝的固相载体上
。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固相基底羟基化的方法包括食人鱼溶液活化法，浓碱溶液活化法，等离子清洗活化法。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合接枝使用的是疏水性试剂与氨基硅烷偶联剂，配比为1～1：10。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述疏水性试剂包括氟硅烷偶联剂，烷基硅烷偶联剂，苯基硅烷偶联剂。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固相基底材料包括玻璃、石英、陶瓷、聚苯乙烯、硅材质以及磁性Fe3O4颗粒作为基底材料。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述固相基底材料的形状是片基、微球状和多孔微珠中的一种或多种；所述固相基底材料为片基时，相对于单位面积所需的混合接枝试剂浓度为0.1％
‑
30％；所述固相基底材料为微球或微...
【专利技术属性】
技术研发人员：伍建，王武，袁征，史艳坤，
申请(专利权)人：北京铭毅智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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