一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用。所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，先根据该基因序列设计引物并通过PCR扩增该基因扩增产物；然后根据该基因序列和pPha

【技术实现步骤摘要】
Chemistry,2019,297:124937)。此外，Wang等在破囊壶菌中异源过表达EPA合成基因簇使其EPA含量提高5倍，产量达到2.7g/L细胞干重(Wang et al.Optimizing eicosapentaenoic acid production by grafting a heterologous polyketide synthase pathway in the Thraustochytrid Aurantiochytrium.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2020,68:11253
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11260)。SnRK2是典型的“一因多效”基因家族，它不仅可以响应逆境胁迫应答，增强植物的抗逆性，而且可参与调控植物生长发育等多个方面。目前对SnRK2的研究主要集中在脱落酸依赖的信号通路，COCSUDRAFT_64904基因就是胶球藻中脱落酸代谢通路上SnRK2基因家族中一员。相关文献表明，外源添加适宜浓度的脱落酸能有效促进微藻生长和油脂积累，此外，其转录组数据显示COCSUDRAFT_64904基因表达出现显著增加现象，然而，COCSUDRAFT_64904基因在微藻油脂合成积累过程中的作用尚未有报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用，以胶球藻脱落酸代谢通路上SnRK2基因家族中的COCSUDRAFT_64904基因为目标基因，探究其在调控微藻生长和脂质合成中的功能及其应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种胶球藻基因，为胶球藻脱落酸代谢通路上SnRK2基因家族中的COCSUDRAFT_64904基因。
[0008]优先地，所述胶球藻基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]上述胶球藻基因在调控生长和脂质合成中的应用，先根据所述胶球藻基因序列设计引物并通过PCR扩增胶球藻基因扩增产物；然后根据胶球藻基因序列和pPha
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T1载体信息设计带有载体同源部分片段和酶切位点的引物，并通过同源重组法将胶球藻基因构建进入pPha
‑
T1载体获得重组质粒；再将重组质粒经电转化转入胶球藻筛选过表达胶球藻基因的阳性重组藻；最后培养过表达胶球藻基因的重组藻获得高油脂产率。
[0010]优先地，所述的通过PCR扩增胶球藻基因扩增产物，具体包括：1)提取胶球藻全基因组作为模板；2)根据胶球藻基因序列设计引物：上游引物序列：5
’‑
GGCTTGTTGGTGGATTGTGAT
‑3’
，下游引物序列：5
’‑
CTCTAGGCGTTGGCGGTTA
‑3’
；3)PCR扩增：通过PCR扩增得到胶球藻基因扩增产物。
[0011]优先地，所述的同源重组法构建重组质粒，具体包括：a)根据COCSUDRAFT_64904的基因序列和pPha
‑
T1载体信息设计引物：上游引物序列：5
’‑
GTCTGCCGTTTCGAGTCTGCCGTTTCGAGGCTTGTTGGTGGATTGTGAT
‑3’
，下游引物序列：5
’‑
ATAGCACGCTTCTGCTCTAGGCGTTGGCGGTTA
‑3’
，引物两端分别包括载体的部分序列(划横线处)和酶切位点(划波浪线处)作为同源臂；b)PCR扩增：通过PCR扩增得到COCSUDRAFT_64904基因扩增产物(带有pPha
‑
T1载体的部分序列和酶切位点)；c)重组质粒的获得：通过同源重组方法，将COCSUDRAFT_64904基因构建进入pPha
‑
T1载体得到重组质粒。
[0012]优先地，步骤b)PCR扩增的反应体系为：体积比为1
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3：25
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30：1
‑
3：1
‑
3：15
‑
20的DNA，2
×
Phanta Max Buffer，上游引物，下游引物和ddH2O，优选为：2μL DNA，27μL 2
×
Phanta Max Buffer，上、下游引物各2μL，17μL ddH2O；PCR扩增程序为：预变性92
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98℃ 2
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5min，变性92
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98℃ 20
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40s，退火50
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60℃ 20
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40s，延伸70
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74℃ 0.5
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2min，彻底延伸6
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12min，20
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40个循环，优选为：预变性95℃ 3min，变性95℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 1min，彻底延伸10min，30个循环；PCR扩增产物用0.5wt％
‑
2wt％(优选1wt％)琼脂糖凝胶电泳纯化回收，得到COCSUDRAFT_64904基因的同源重组扩增产物。
[0013]优先地，步骤c)具体为将pPha
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T1双酶切产物与COCSUDRAFT_64904同源重组产物进行同源重组反应，反应体系为：用量比为80
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120ng：80
‑
120ng：1
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3μL：3
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5μL：8
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12μL的pPha
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T1双酶切产物，COCSUDRAFT_64904PCR同源重组产物，Exnase II，5
×
CE II Buffer和ddH2O，36
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38℃反应25
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35min；优选为：100ng pPha
‑
T1双酶切产物，100ng COCSUDRAFT_64904PCR同源重组产物，2μL Exnase II，4μL 5
×
CE II Buffer，10μL ddH2O，37℃反应30min；将同源产物进行大肠杆菌转化，鉴定获得含有pPha
‑
T1
‑
COCSUDRAFT_64904重组质粒的阳性菌。
[0014]优先地，所述的过表达胶球藻基因的阳性重组藻构建为将获得的重组质粒通过电转化方法转入胶球藻中，并通过抗生素筛选和表达量检测方式筛选得到过表达COCSUDRAFT_64904基因的阳性重组藻株。
[0015]优先地，所述的过表达胶球藻基因的阳性重组藻构建，具体为将pPha
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T1
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COCSUDRAFT_64904质粒用Sca I进行质粒线性化处理，酶切体系为：20μL pPha
‑
T1
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胶球藻基因，其特征在于，所述胶球藻基因为胶球藻脱落酸代谢通路上SnRK2基因家族中的COCSUDRAFT_64904基因。2.根据权利要求1所述的胶球藻基因，其特征在于，所述胶球藻基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.权利要求1或2所述的胶球藻基因在调控生长和脂质合成中的应用，其特征在于，先根据所述胶球藻基因序列设计引物并通过PCR扩增胶球藻基因扩增产物；然后根据胶球藻基因序列和pPha
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T1载体信息设计带有载体同源部分片段和酶切位点的引物，并通过同源重组法将胶球藻基因构建进入pPha
‑
T1载体获得重组质粒；再将重组质粒经电转化转入胶球藻筛选过表达胶球藻基因的阳性重组藻；最后培养过表达胶球藻基因的重组藻获得高油脂产率。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的通过PCR扩增胶球藻基因扩增产物，具体包括：1)提取胶球藻全基因组作为模板；2)根据胶球藻基因序列设计引物：上游引物序列：5
’‑
GGCTTGTTGGTGGATTGTGAT
‑3’
，下游引物序列：5
’‑
CTCTAGGCGTTGGCGGTTA
‑3’
；3)PCR扩增：通过PCR扩增得到胶球藻基因扩增产物。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，同源重组法构建重组质粒，具体包括：a)根据COCSUDRAFT_64904的基因序列和pPha
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T1载体信息设计引物：上游引物序列：5
’‑
GTCTGCCGTTTCGAGGCTTGTTGGTGGATTGTGAT
‑3’
，下游引物序列：5
’‑
ATAGCACGCTTCTGCTCTAGGCGTTGGCGGTTA
‑3’
，引物两端分别包括载体的部分序列即划横线处和酶切位点即划波浪线处作为同源臂；b)PCR扩增：通过PCR扩增得到COCSUDRAFT_64904基因扩增产物(带有pPha
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T1载体的部分序列和酶切位点)；c)重组质粒的获得：通过同源重组方法，将COCSUDRAFT_64904基因构建进入pPha
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T1载体得到重组质粒。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤b)PCR扩增的反应体系为：体积比为1
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3：25
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30：1
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3：1
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3：15
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20的DNA，2
×
Phanta Max Buffer，上游引物，下游引物和ddH2O；PCR扩增程序为：预变性92
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98℃2
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5min，变性92
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98℃20
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40s，退火50
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60℃20
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40s，延伸70
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【专利技术属性】
技术研发人员：李玉芹，任站，胡雅婷，陈赛兰，钱娅，
申请(专利权)人：湘潭大学，
类型：发明
国别省市：