同时检测5种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种同时检测5种CTV基因型的多重RT

【技术实现步骤摘要】
ID No.2所示；
[0008]VT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，VT下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0009]T3上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，T3下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0010]RB上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，S1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
[0011]T36上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，T36下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
[0012]本专利技术还提供了上述的多重RT
‑
PCR引物组在制备同时检测S1、VT、T3、RB、T36柑橘衰退病毒基因型的试剂中的应用。
[0013]本专利技术还提供了同时检测S1、VT、T3、RB、T36柑橘衰退病毒基因型的试剂盒，包括上述的多重RT
‑
PCR引物组。
[0014]优选的，所述试剂盒包括PCR反应体系、RT反应体系、阳性质控品和阴性质控品。
[0015]优选的，所述RT反应体系包括解链液5μL、5
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RT
‑
buffer 4μL、30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5μL、100U/μL的反转录酶RTase 1μL、无RNase超纯水4.5μL，10μmol/L反转录引物1μL。
[0016]优选的，所述解链液由10μmol/L随机引物1.0μL、2.5mM/L dNTPs 1.0μL和RNA 3.0μL模板组成。
[0017]优选的，所述PCR反应体系包括无RNase超纯水12.1μL、10
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PCR
‑
buffer 4.5μL、2.5mM/L的dNTPs 2μL，10μmol/L上述的多重RT
‑
PCR引物组的上下游引物0.5μL、r
‑
Taq酶0.4μL、反转录产物cDNA模板1μL。
[0018]本专利技术还提供了一种利用上述试剂盒同时检测5种柑橘衰退病毒基因型的方法，包括以下步骤：利用所述多重RT
‑
PCR引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物进行片段分析，得到待测样品是否受S1、VT、T3、RB和T36中的一种或多种CTV基因型侵染。
[0019]优选的，所述PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸50秒，35个循环。
[0020]优选的，所述片段分析是对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定待测样品中是否受S1、VT、T3、RB和T36中的一种或多种CTV基因型侵染。
[0021]相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0022]本专利技术提供了一种同时检测5种CTV基因型的多重RT
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PCR引物组、试剂盒与应用，本专利技术针对目前常见的CTV基因型全基因序列的差异设计了多对特异性引物，本专利技术的多重RT
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PCR引物组或试剂盒具有特异性强、灵敏度高的特点，当S1、VT、T3、RB、T36 CTV基因型同时存在时，该多重RT
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PCR引物组能够特异性检测S1、VT、T3、RB、T36这5种CTV基因型，且DNA扩增片段大小适宜，多重PCR结果容易辨认。在cDNA模板稀释到10
‑2时仍可以检测到S1、VT、T3、RB、T36这5种基因型，在模板稀释到10
‑3时可以检测到VT、T3、RB、T36这4种基因型，在模板稀释到10
‑4时可以检测到VT、T36这2种基因型。本专利技术的试剂盒使CTV基因型检测过程更简便、更高效，大大节省了基因型检测周期，对完善CTV基因型的检测和防控有积极作用。
附图说明
[0023]图1为CTV基因型多重RT
‑
PCR引物组的特异性检测结果，其中，+：对应基因型的阳性样品；
‑
：健康植株作为阴性对照；1：VT和T3混合侵染；2：T3和RB混合侵染；3：VT和T36混合侵染；4：RB和T36混合侵染；5：VT和RB混合侵染；6：S1和RB混合侵染；7：S1和T3混合侵染；8：VT、T3和RB混合侵染；9：VT、T3和T36混合侵染；10：S1、VT和T3混合侵染；11：S1、VT和RB混合侵染；12：S1、T3和RB混合侵染；13：T3、RB和T36混合侵染；14：VT、RB和T36混合侵染；15：S1、T3和T36混合侵染；16：S1、VT和T36混合侵染；17：S1、VT、T3和RB混合侵染；18：S1、VT、RB和T36混合侵染；19：S1、T3、RB和T36混合侵染；20：S1、VT、T3和T36混合侵染；21：VT、T3、RB和T36混合侵染；22：S1、VT、T3、RB和T36混合侵染；
[0024]图2为CTV基因型多重RT
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PCR引物组灵敏性检测结果。
具体实施方式
[0025]本专利技术提供了一种同时检测5种柑橘衰退病毒基因型的多重RT
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PCR引物组，所述5种柑橘衰退病毒基因型为S1、VT、T3、RB、T36；所述多重RT
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PCR引物组是由用于检测S1的引物、用于检测VT的引物、用于检测T3的引物、用于检测RB的引物和用于检测T36的引物组成；
[0026]S1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，S1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0027]VT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，VT下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0028]T3上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，T3下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0029]RB上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，S1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
[0030]T36上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，T36下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
[0031]本专利技术针对目前常见的CTV基因型全基因序列的差异设计了多对特异性引物，上述多重RT
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PCR引物组可以快速、准确的同时区分S1、VT、T3、RB、T36这5种CTV基因型，极大的提高CTV基因型检测的速率和效率。
[0032]本专利技术还提供了上述的多重RT
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PCR引物组在制备同时检测S1、VT、T3、RB、T36柑橘衰退病毒基因型的试剂中的应用。
[0033]本专利技术还提供了同时检测S1、VT、T3、RB、T36柑橘衰退病毒基因型的试剂盒，包括上述的多重RT
‑
PCR引物组。
[0034]在本专利技术中，所述试剂盒优选的包括PCR反应体系、RT反应体系、阳性质控品和阴性质控品。所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测5种柑橘衰退病毒基因型的多重RT
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PCR引物组，其特征在于，所述5种柑橘衰退病毒基因型为S1、VT、T3、RB、T36；所述多重RT
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PCR引物组是由用于检测S1的引物、用于检测VT的引物、用于检测T3的引物、用于检测RB的引物和用于检测T36的引物组成；S1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，S1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；VT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，VT下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；T3上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，T3下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；RB上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，S1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；T36上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，T36下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。2.权利要求1所述的多重RT
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PCR引物组在制备同时检测S1、VT、T3、RB、T36柑橘衰退病毒基因型的试剂中的应用。3.一种同时检测S1、VT、T3、RB、T36柑橘衰退病毒基因型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的多重RT
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PCR引物组。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应体系、RT反应体系、阳性质控品和阴性质控品。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RT反应体系包括解链液5μL、5
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【专利技术属性】
技术研发人员：周俊，易龙，李双花，韩镕琰，王长宁，
申请(专利权)人：赣南师范大学，
类型：发明
国别省市：