靶向HBA基因的sgRNA及食蟹猴HBA基因敲除的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及靶向HBA基因的sgRNA及食蟹猴HBA基因敲除的方法。本发明专利技术通过设计、构建、筛选，体外合成本发明专利技术所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，并将其与Cas9mRNA混合注射入食蟹猴胚胎，得到HBA基因敲除的食蟹猴胚胎。本发明专利技术经敲除效果检测鉴定，能有效在食蟹猴胚胎上实现HBA基因的基因敲除，为建立非人灵长类α地中海贫血动物模型奠定了坚实基础。础。础。

【技术实现步骤摘要】
靶向HBA基因的sgRNA及食蟹猴HBA基因敲除的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，公开了靶向HBA基因的sgRNA及食蟹猴HBA基因敲除的方法。

技术介绍

[0002]α地中海贫血(简称α地贫)是由于HBA基因缺失或功能缺陷，导致α珠蛋白合成障碍的一种溶血性贫血。目前已经报道了超过120种突变导致α地中海贫血，HBA基因突变分为缺失型α地中海贫血和非缺失型α地中海贫血两种类型，缺失型α地中海贫血是由于HBA基因大片段的缺失引起，缺失片段长度为3～100kb不等。α地中海贫血除了主要由HBA基因缺失引起外，也有部分是由于HBA基因点突变、小片段缺失或碱基插入引起，这类α地中海贫血称为非缺失型α地中海贫血。由上可知，敲除食蟹猴HBA基因能降低食蟹猴α珠蛋白的表达，有可能为制造非人灵长类α地中海贫血动物模型提供新的有效方法，为相关疾病的分子机制和重要靶点挖掘和验证提供机遇，同时也为基因治疗、干细胞治疗以及精准治疗提供重要工具。
[0003]动物疾病模型是研究疾病十分重要的工具之一，目前有报道过小鼠α地中海贫血的动物模型，但缺少非人类灵长类动物的α地中海贫血模型。研究人员希望通过基因敲除技术制备HBA基因敲除的非人类灵长类胚胎模型，能为建立非人灵长类α地中海贫血模型提供思路。
[0004]综上所述，制备HBA基因敲除的非人类灵长类胚胎模型，对于建立α地中海贫血动物模型具有重要意义。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种靶向HBA基因的sgRNA，其中HBA基因来自食蟹猴。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种食蟹猴HBA基因敲除的方法，该方法为食蟹猴胚胎上的基因敲除方法，为建立非人灵长类α地中海贫血模型提供思路。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种靶向敲除HBA基因的sgRNA，所述sgRNA为HBA
‑
sgRNA3或/和HBA
‑
sgRNA6，其核苷酸序列如下所示：
[0008]HBA
‑
sgRNA3:5
’‑
GCACAAGCTTCGGGTGGACC(CGG)
‑3’
；
[0009]HBA
‑
sgRNA6:5
’‑
GAAGGACAGGAACATCCTGC(GGG)
‑3’
。
[0010]其中，括号内为PAM位点NGG，sgRNA识别位点。
[0011]本专利技术提供所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA在HBA基因敲除领域中的应用。
[0012]本专利技术还提供所述的食蟹猴HBA基因敲除的方法，包括如下步骤：体外合成本专利技术所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，与Cas9 mRNA混合后体外注射入食蟹猴胚胎，得到HBA基因敲除的食蟹猴胚胎。
[0013]优选地，所述体外合成靶向敲除HBA基因的sgRNA的具体操作步骤如下：
[0014](1)根据本专利技术所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，设计合成引物X，然后以px459载体为模板，进行PCR扩增，得到转录DNA模板；
[0015](2)将步骤(1)制得的转录DNA模板转录，得到所述sgRNA。
[0016]具体处理是将sgRNA和Cas9 mRNA以及无酶水进行混合，使sgRNA终浓度为50ng/μL，Cas9 mRNA终浓度为100ng/μL。将混合后的载体通过显微注射技术注射进食蟹猴受精卵中，每个受精卵注射4～10皮升，至看到受精卵种有明显的细胞质流动。食蟹猴胚胎使用HECM
‑
9培养液进行培养，隔天换液，正常三天生长到八细胞，五天生长到桑椹胚，七天生长到囊胚。
[0017]更具体地，所述引物X核苷酸序列如下所示：
[0018]sgRNA
‑
F:
[0019]5’‑
TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
‑3’
；
[0020]gRNA
‑
R:5
’‑
AGCACCGACTCGGTGCCACTT
‑3’
；
[0021]其中，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为sgRNA序列，不包括PAM序列。
[0022]更优选地，所述的引物X的核苷酸序列如下所示：
[0023]HBA
‑
sgRNA3
‑
F:5
’‑
TAATACGACTCACTATAGGCACAAGCTTCGGGTGGACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
‑3’
；
[0024]HBA
‑
sgRNA3
‑
R:5
’‑
AGCACCGACTCGGTGCCACTT
‑3’
；
[0025]HBA
‑
sgRNA6
‑
F:5
’‑
TAATACGACTCACTATAGGAAGGACAGGAACATCCTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
‑3’
；
[0026]HBA
‑
sgRNA6
‑
R:5
’‑
AGCACCGACTCGGTGCCACTT
‑3’
。
[0027]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0028](1)本专利技术针对食蟹猴HBA基因提供了2个高效的敲除靶点。
[0029](2)本专利技术经敲除效果检测鉴定，能有效在食蟹猴胚胎上实现HBA基因的基因敲除，为建立非人灵长类α地中海贫血动物模型奠定了坚实基础。
附图说明
[0030]图1是sgRNA体外靶位点活性检测酶切结果图；
[0031]图2是突变型胚胎测序峰图。
具体实施方式
[0032]为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体附图和实施例对本专利技术作进一步说明。实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]为了更清楚、详细地解释本专利技术的技术方案，以下提供一些实施例和对比例作进一步的说明。
[0034]实施例1
[0035]本实施例为HBA基因靶点效率检测
[0036](1)设计靶点
[0037]针对食蟹猴HBA基因，在食蟹猴HBA基因第二外显子处设计sgRNA，使用CRISPR在线
网站(http://crispr.mit.edu/)根据评分系统，根据食蟹猴HBA基因的DNA序列(gatgttcctg tccttcccca ccaccaagac ctacttcccc cacttcgacc tgagccacgg ctc本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向敲除HBA基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为HBA
‑
sgRNA3或/和HBA
‑
sgRNA6，其核苷酸序列如下所示：HBA
‑
sgRNA3:5
’‑
GCACAAGCTTCGGGTGGACC(CGG)
‑3’
；HBA
‑
sgRNA6:5
’‑
GAAGGACAGGAACATCCTGC(GGG)
‑3’
。2.一种sgRNA的应用，其特征在于，所述sgRNA为权利要求1所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，所述应用为sgRNA在HBA基因敲除领域中的应用。3.一种食蟹猴HBA基因敲除的方法，其特征在于，包括如下步骤：体外合成权利要求1所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，与Cas9 mRNA混合后体外注射入食蟹猴胚胎，得到HBA基因敲除的食蟹猴胚胎。4.如权利要求3所述的食蟹猴HBA基因敲除的方法，其特征在于，所述体外合成靶向敲除HBA基因的sgRNA的操作步骤如下：(1)根据权利要求1所述的靶向敲除HBA基因的sgRNA，设计合成引物X，然后以px459载体为模板，进行PCR扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨世华，曾靖滔，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：