一种用于SmallRNA的测序方法、测序试剂和应用技术

本申请公开了一种用于Small RNA的测序方法、测序试剂和应用。本申请用于Small RNA的测序方法，包括在对混合样本的环状文库进行测序时，向引物溶液中添加正常测序引物和阻断测序引物，采用混合引物进行测序；阻断测序引物由正常测序引物3

【技术实现步骤摘要】
一种用于Small RNA的测序方法、测序试剂和应用
[0001]本申请是分案申请，原申请的申请号是：201710855713.X，申请日是2017年09月20日，专利技术名称为“一种用于Small RNA的测序方法、测序试剂和应用”。


[0002]本申请涉及基因测序领域，特别是涉及一种用于Small RNA的测序方法、测序试剂和应用。

技术介绍

[0003]Small RNA，包括micro RNAs、siRNAs和pi RNAs，是一大类调控分子，几乎存在于所有的生物体中，是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢和疾病的发生等生理过程中都起着重要的作用。通过对Small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的Small RNA图谱，实现包括新Small RNA分子的挖掘，Small RNA作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、Small RNA聚类和表达谱分析等科学应用。Small RNA通过多种多样的作用途径，包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除等，来调控生物体的生长发育和疾病发生，因此Small RNA具有很高的科研价值，研究学者非常热衷Small RNA的相关研究，于是对Small RNA的测序就变成高度关注的热点。
[0004]目前各个测序平台测序Small RNA的方法，一种是通过链状的文库进行测序的，一种是进行环状文库测序的。其中，环状文库测序是将Small RNA进行环化，形成环状文库；再以环状文库为模板生成DNA纳米球，此DNA纳米球是多拷贝的链状待测链，每一个拷贝均和环状文库互补；对这个多拷贝的链状待测链进行测序，以获得目标区域的序列。环状文库Small RNA测序存在一个重要的缺陷就是，当多个样本混合测序时，通常会对不同样本添加不同的标签序列，由于Small RNA本身的小片段性，仅有18
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30nt，为了获得更多的数据，通常将测序读长设置为50循环；这使得进行目标片段区域测序时，大部分标签序列包括其引物区域，会被测序目标片段的新生成链覆盖，导致再进行标签序列测序时，无法结合上标签序列的引物，即不能完成标签序列的测序；这会导致两个很严重的问题，第一，因为不能完成标签序列的测序，无法区分不同的样本，所以这些数据将会被过滤弃掉，即大部分数据都是不可用数据，对测序资源造成极大浪费；第二，因为大部分数据都是不可用数据，导致不能获得较好的拆分率。
[0005]因为以上问题和缺陷，目前的环状文库Small RNA测序，如果想获得较多的数据，每次只能测序一个样本，不能多个样本混合同时进行测序。而目前的测序平台通常都具有高通量测序的能力，每次却只测序一个样本，这也会造成测序资源的极大浪费。

技术实现思路

[0006]本申请的目的是提供一种改进的用于Small RNA的测序方法，以及该测序方法采用的测序试剂，及其应用。
[0007]本申请采用了以下技术方案：
[0008]本申请的一方面公开了一种用于Small RNA的测序方法，包括在对混合样本的环状文库进行测序时，向引物溶液中添加正常测序引物和阻断测序引物，组成混合引物，采用混合引物进行测序；其中，阻断测序引物由正常测序引物的3
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末端的羟基经过化学修饰而成。
[0009]需要说明的是，本申请中，正常测序引物即现有的测序平台中采用的测序引物，阻断测序引物即由正常测序引物3
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末端羟基经过化学修饰而成，正常测序引物即正常的、3
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末端羟基没有经过化学修饰的引物。本申请的关键在于在测序过程中同时使用常规测序引物和阻断测序引物；正常来说，如图4所示，正常测序引物的3
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末端的羟基没有经过修饰的情况下，在进行合成时，正常测序引物结合到待测模板链上后，其最后一个碱基即3
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末端的的羟基是暴露在外面的，会与溶液中游离dNTPs的磷酸基团发生化学反应结合在一起，具体的游离dNTPs依据与待测模板的碱基互补配对原则进行选择，新接入的dNTPs也携带一个羟基基团，与下一个dNTPs的磷酸基团结合，实现延伸；而本申请的阻断测序引物由于3
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末端的羟基被化学修饰，如图5所示，因此，无法实现延伸，起到阻断测序的作用。可以理解，本申请的阻断测序引物是根据测序引物化学修饰而来的，至于具体的测序引物序列，不同的测序平台，其具体测序引物序列各不相同，但都可以采用本申请的方法进行混合样本的Small RNA环状文库测序，因此，正常测序引物和阻断测序引物的序列在此不做具体限定。再例如，对于Illumina测序平台，其原理为桥式扩增，引物为基于I5、I7接头设计的两种引物，这两种引物适用于其同系列的所有平台。基于本专利技术的原理设计前述两种引物的阻断引物，同样可以用于Illumina测序平台。另外，化学修饰的作用是避免羟基和磷酸基团的结合，阻断延伸，因此，现有的羟基修饰方法都可以用于本申请，例如对羟基进行消除，再氢化，以H替换羟基；又如采用碱金属对羟基进行置换反应，将
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OH修饰为
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OY，其中Y为碱金属元素；又或者采用烃基或其它基团进行取代反应，脱水成醚；在此不做具体限定。
[0010]还需要说明的是，环状文库测序的对象是DNA纳米球，而DNA纳米球是多拷贝的链状待测链，也就是说在DNA纳米球的测序模板链上存在多个正常测序引物的结合位点，当然也存在多个阻断测序引物的结合位点，而阻断测序引物的随机结合，实际上相当于占用了一个空位，因为阻断测序引物结合到测序模板链上后不会延伸，因此，不会对其后的标签序列进行覆盖，这样就保留了至少一个拷贝的标签序列，使得标签序列可以进行正常测序。因此，在采用本申请的测序方法对混合样本的环状文库进行Small RNA测序时，可以正常的对标签序列进行测序，有效的提高数据利用率，并能够获得良好的拆分率，使得混合样本环状文库的Small RNA测序得以实现。
[0011]优选的，化学修饰包括对羟基整体或羟基中的H进行替换。
[0012]需要说明的是，化学修饰的作用是将3
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末端的羟基封闭，避免其与磷酸基团结合，从而达到阻断延伸的目的，因此，凡是能与羟基反应的化学修饰都可以用于本申请。
[0013]优选的，阻断测序引物占所述混合引物总量的10％
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70％。
[0014]需要说明的是，阻断测序引物添加量越多，最终标签引物的测序数据就越多，而相应的因为阻断测序引物占用空位阻断Small RNA目标区域的测序，Small RNA目标区域的测序数据就越少。因此，总的来说，阻断测序引物的具体用量可以根据靶标序列的数量而定，本身存在比较多的靶标序列的情况下，可以添加更多的阻断测序引物，以获得更多的标签引物的测序数据；反之，如果靶标序列较少，为了保障Small RNA目标区域的测序数据，则阻
断测序引物的添加量就少。从这个角度来说，混合样本中各样本的数量本身要足够大，如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于Small RNA的测序试剂，其特征在于：所述测序试剂中包括阻断测序引物，所述阻断测序引物由正常测序引物的3
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末端的羟基经过化学修饰而成。2.根据权利要求1所述的测序试剂，其特征在于：所述化学修饰包括对羟基整体或羟基中的H进行替换。3.根据权利要求1所述的测序试剂，其特征在于：所述测序试剂中还包括正常测序引物，所述阻断测序引物占混合引物总量的10％
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70％，所述混合引物是由阻断测序引物和正常测序引物混合得到。4.根据权利要求3所述的测序试剂，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李计广，马可心，赵芳，邱敏，韦小芳，冯太青，龙小娟，齐晓娟，王静静，刘二凯，陈奥，徐崇钧，章文蔚，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：