利用弱化了rhaB基因的大肠杆菌提高细胞内ATP水平的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用弱化了rhaB基因的大肠杆菌提高细胞内ATP水平的方法。本发明专利技术提供的大肠杆菌弱化了rhaB基因的表达，在培养过程中，细胞内能够提供更高的ATP水平。同时，在以大肠杆菌构建的L

【技术实现步骤摘要】
利用弱化了rhaB基因的大肠杆菌提高细胞内ATP水平的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种弱化了rhaB基因的大肠杆菌以及利用其提高细胞内ATP水平的方法。

技术介绍

[0002]大肠杆菌因其具有遗传背景清晰、生长快速、基因编辑技术成熟等优点，常被作为底盘细胞以生产多种不同的天然产物，其生产的天然产物在医药、工业、食品、化妆品、畜牧业等领域有广泛的应用。工程大肠杆菌在生产不同的天然产物时，一个很重要的影响因素是大肠杆菌菌株细胞内腺苷三磷酸(ATP)的供应量。
[0003]ATP是微生物生长、繁殖的基础，其在天然产物转运、天然产物合成及物质分解等多种代谢过程(Xu N,Ye C,Chen X,et al.Genome
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scale metabolic modelling common cofactors metabolism in microorganisms[J].Journal of Biotechnology,2017,251:1
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13.)中都有重要的参与。大肠杆菌中大量的酶催化反应都需要ATP的参与；在复杂的代谢网络体系中，ATP可以作为辅因子助力代谢流的分配(Y Chen.ATP regulation strategy and its application in the synthesis of microbial metabolites.[J].Chinese journal of biotechnology,2020,36(8):1515
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1527.)；此外，ATP也具有调控基因的转录和表达、影响全局转录调控因子和信号转导系统的作用。所以，调控大肠杆菌细胞内ATP的含量能够有效促进目标天然产物的高效合成。
[0004]调控大肠杆菌细胞内ATP含量的方法有以下几种：1)调控与ATP合成活性有关的组分。该方法主要利用高效的基因编辑技术对底盘微生物中编码与ATP合成活性有关组分的基因进行调控。与ATP合成活性有关的组分共有四种，分别是F0F1‑
ATPase组分：atpF、atpH、atpA、atpG、atpD、atpC这些基因编码F0F1‑
ATPase复合物的亚基，增强这些基因会激活糖酵解途径；糖原合成组分：glgA、glgB编码糖原合成组分，失去其中的一个基因，会因为中断旁路葡萄糖的消耗而进一步促进糖酵解途径；嘧啶核糖核苷酸从头生物合成的有关组分：缺失嘧啶核糖核苷酸从头生物合成的有关基因，可能上调有关ATP在内的从头核苷酸的合成；磷酸转移酶系统：缺失有关磷酸转移酶系统的有关基因，可通过糖酵解激活葡萄糖激酶来上调ATP的合成。2)敲除底盘微生物中多余耗能基因。该方法主要利用高效的基因编辑技术对底盘微生物中多余耗能基因进行敲除，以达到节省ATP消耗的目的。有研究表明，同时敲除ysaA、ydaS、ybiX可将生产色氨酸菌株内的ATP水平提高到323％(CN105695381A)。

技术实现思路

[0005]针对现有技术不足，本专利技术目的是提供一种通过进行了基因修饰的大肠杆菌调控细胞内ATP水平的方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采取如下的技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种大肠杆菌，其已经过修饰而弱化了rhaB基因的表达。
[0008]第二方面，本专利技术提供一种提高细胞内ATP水平的方法，包括：在培养基中培养如
上所述的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌已经过修饰而弱化了rhaB基因的表达，使其与未经过修饰的大肠杆菌相比培养后细胞内ATP水平提高。
[0009]本专利技术的有益效果如下：
[0010]rhaB基因编码鼠李糖激酶RhaB，该酶参与鼠李糖代谢反应中的第二步，其催化鼠李糖转化为鼠李糖
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磷酸，该步反应过程伴随着ATP的消耗。然而，针对rhaB基因表达强度的弱化对提升大肠杆菌细胞内ATP含量的影响还未有研究，特别的，目前还未有关于利用弱化rhaB基因表达强度的大肠杆菌在生产天然产物时，能够提高工程菌株细胞内ATP含量的报道。本专利技术提供的大肠杆菌弱化了rhaB基因的表达，在培养过程中，细胞内能够提供更高的ATP水平。同时，在以大肠杆菌构建的L
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精氨酸、L
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缬氨酸、L
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组氨酸、麦角硫因等生产菌株中，弱化rhaB基因的表达也能够提高生产菌株细胞中ATP水平。
具体实施方式
[0011]下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。
[0012]第一方面，本专利技术提供一种大肠杆菌，其已经过修饰而弱化了rhaB基因的表达，使其与未经修饰的大肠杆菌相比所述rhaB基因的表达水平降低，例如，降低了50％，60％，70％，80％，90％，100％。
[0013]第二方面，本专利技术提供一种提高细胞内ATP水平的方法，包括：在培养基中培养如上所述的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌已经过修饰而弱化了rhaB基因的表达，使其与未经过修饰的大肠杆菌相比培养后细胞内ATP水平提高，例如，提高了150％或更多，200％或更多，300％或更多。
[0014]根据本专利技术，可以使rhaB基因缺失或失活。
[0015]根据本专利技术，还可以使rhaB基因连接弱启动子控制其表达，例如BBa
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J23113、BBa
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J23114、BBa
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J23117等。
[0016]根据本专利技术，所述大肠杆菌可以是任意的大肠杆菌，例如常见的E coli MG1655、E coli W3110、E coli BL21、E.coli BW25113等，以及在其基础上进行过定向或不定向改造得到的大肠杆菌。
[0017]根据本专利技术，所述rhaB基因不限于NCBI GeneID:948399所示的核苷酸序列，还可以包括作为NCBI GeneID:948399所示序列的突变体核苷酸序列或与NCBI GeneID:948399所示序列同源、且编码鼠李糖激酶(NCBI Protein_ID：NP_418340.1)的突变体的基因。所述rhaB基因可以是由于遗传密码的简并性所致的变体核苷酸序列。
[0018]根据本专利技术，所述大肠杆菌的培养可以采用本领域常规方法进行。培养基可以是合成的或天然的培养基，例如含有碳源、氮源、硫源、无机离子和需要的其它有机和无机组分的典型培养基。
[0019]所述大肠杆菌可以在需氧条件下进行培养，持续16至72小时，或20至48小时，或26至30小时；培养温度可以控制在30至45℃，或30至37℃内；且pH可以调节在5.0至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高大肠杆菌细胞内ATP水平的方法，包括：在培养基中培养所述大肠杆菌，其中所述大肠杆菌已经过修饰而弱化了rhaB基因的表达，使其与未经过修饰的大肠杆菌相比培养后细胞内ATP水平提高。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rhaB基因缺失或失活。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴鹤云，郭金玺，谢希贤，蒋帅，高志强，帅珍龙，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：