提高赖氨酸和戊二胺发酵产量的方法技术

本发明专利技术提供一种提高赖氨酸和戊二胺发酵产量的方法，其是一种动态调控细胞内NADH和NADPH含量的方法，通过利用受生长调控的启动子Pald控制谷氨酸棒杆菌中gapA基因的表达，以及利用Psod启动子控制额外引入的gapN基因的表达，使得生长早期gapA的表达较强从而维持细胞内正常的NADH浓度和细胞生长速度，而在指数生长中后期以及细胞生长稳定期，由于Pald表达强度的急剧降低以及Psod的表达强度的急剧提高，gapN获得高表达，使得在细胞内NADPH浓度显著提高，从而显著提高赖氨酸的产量和得率，该策略同样适用于显著提高戊二胺的产量。策略同样适用于显著提高戊二胺的产量。

【技术实现步骤摘要】
提高赖氨酸和戊二胺发酵产量的方法


[0001]本专利技术属于生物化工
，具体地说，涉及一种提高赖氨酸和戊二胺发酵产量的方法。

技术介绍

[0002]赖氨酸是一种重要的必需氨基酸，在饲料添加剂、医药、保健品等领域有广泛的应用。赖氨酸的工业生产主要是通过微生物发酵的方法，常用的工业菌种包括谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。在赖氨酸的生物合成过程中，每合成一分子的赖氨酸需要消耗4分子的NADPH。因此，强化NADPH的供给对于提高赖氨酸的产量具有至关重要的作用，目前已经报道的方法包括强化戊糖磷酸循环途径的关键基因表达以提高其代谢通量，通过表达转氢酶基因以实现从NADH到NADPH的转化，用NADH依赖型的脱氢酶替代赖氨酸合成途径中NADPH依赖型的氨基酸脱氢酶。戊二胺的生物合成同样高度依赖NADPH的供给，戊二胺是通过在赖氨酸生产菌株中表达赖氨酸脱羧酶获得的。
[0003]NADPH依赖型的甘油醛
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磷酸脱氢酶催化甘油醛
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磷酸的不可逆氧化并产生NADPH。之前的文献研究发现，将谷氨酸棒杆菌中NADH依本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌是将谷氨酸棒杆菌的甘油醛
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磷酸脱氢酶基因gapA的启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源的乙醛脱氢酶基因启动子Pald，并将外源的NADPH依赖型的甘油醛
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磷酸脱氢酶基因经密码子优化后，通过质粒导入谷氨酸棒杆菌中或通过基因工程手段整合到谷氨酸棒杆菌染色体上构建得到的。2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述NADPH依赖型的甘油醛
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磷酸脱氢酶基因来源于变形链球菌(Streptococcus mutans)。3.根据权利要求2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述NADPH依赖型的甘油醛
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磷酸脱氢酶基因由Psod启动子驱动。4.根据权利要求1
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3任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，出发菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC 21543。5.重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括：利用基因工程手段将谷氨酸棒杆菌的甘油醛
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磷酸脱氢酶基因gapA的启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源的乙醛脱氢酶基因启动子Pald，并在谷氨酸棒杆菌中过表达由Psod启动子驱动的来源于变形链球菌的NADPH依赖型的甘油醛
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磷酸脱氢酶基因gapN。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、重组菌C.glutamicum
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ald的构建a1、以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald
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up
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F和ald
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up
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R为引物进行PCR，获得基因片段ald
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up并进行PCR产物纯化；以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald
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F和ald
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R为引物进行PCR，获得基因片段ald并进行PCR产物纯化；以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald
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down
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F和ald
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down
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R为引物进行PCR，获得基因片段ald
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down并进行PCR产物纯化；a2、将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将基因片段ald
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up、ald、ald
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down一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18
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ald；a3、将pK18
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ald转化到谷氨酸棒杆菌ATCC 21543中，获得的重组菌命名为C.glutamicum
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ald；所述重组菌C.glutamicum
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ald包含序列如SEQ ID NO:1所示的由Pald启动子驱动的甘油醛
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈振，董雨菲，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：