一种骨和软骨中解旋胶原的染色方法技术

本发明专利技术属于组织染色技术领域，公开了一种骨和软骨中解旋胶原的染色方法。染色方法，依次包括以下步骤：(1)组织的固定；(2)采用荧光染料或生物素标记的胶原杂交肽进行染色；(3)脱钙；(4)切片；(5)成像。该染色方法能够很好地区分和辨识骨和软骨组织中的完整胶原和解旋胶原，从而更客观、更微观的评价骨组织和软骨组织中的胶原分子结构。组织中的胶原分子结构。组织中的胶原分子结构。

【技术实现步骤摘要】
一种骨和软骨中解旋胶原的染色方法


[0001]本专利技术属于组织染色
，具体涉及一种骨和软骨中解旋胶原的染色方法。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是一类结构相关的蛋白质家族，广泛存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱和血管中，是结缔组织主要的结构蛋白，起到支持结构器官、保护机体的作用。其中，现有检测骨和软骨组织胶原的染色方法主要有：H&E、马松三色、胶原抗体的免疫组化和免疫荧光染色。然而，上述染色方法均不能很好地区分和辨识骨和软骨组织中的完整胶原和解旋胶原(即胶原三螺旋结构打开的胶原分子，或称变性胶原)。
[0003]因此，本专利技术希望提出一种用于骨和软骨中解旋胶原的新染色方法，从而更客观、更准确地评价骨组织和软骨组织中的胶原分子结构变化。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种骨和软骨中解旋胶原的染色方法，该染色方法能够很好地区分和辨识骨和软骨组织中的完整胶原和解旋胶原，从而更客观、更准确地评价骨组织和软骨组织中的胶原分子结构变化。
[0005]本专利技术提供一种骨和软骨中解旋胶原的染色方法，依次包括以下步骤：(1)组织的固定；(2)采用荧光染料或生物素标记的胶原杂交肽(CHP)进行染色；(3)脱钙；(4)切片；(5)成像。
[0006]胶原蛋白分子具有独特的三螺旋结构，经酶解的胶原分子其三螺旋犹如拉链一般被解旋开来。而胶原杂交肽(CHP)是一种新颖且独特的肽，其可以在体内外特异性结合未折叠的胶原链，即可与解旋变性的胶原链进行杂交，并具有化学性质稳定的特点，因而使用范围广泛，可以在不同种属样本中进行使用。
[0007]本专利技术指出，传统的骨和软骨的胶原染色方法中所采用的“先脱钙”的方式会导致骨组织中胶原的解旋，使得后续对骨组织中解旋胶原的检测呈现“假阳性”的结果，而软骨和骨组织紧密相连，骨组织中异常高的“假阳性”结果也会严重影响对软骨中解旋胶原的检测。而本专利技术通过先利用胶原杂交肽(CHP)与解旋蛋白进行结合，再进行脱钙的方式，能够有效甄别和鉴定骨和软骨中解旋的胶原分子。
[0008]优选地，步骤(1)中进行组织的固定后还包括对组织进行切开的步骤。对组织进行切开可便于后续的染色操作。
[0009]优选地，采用多聚甲醛(PFA)或福尔马林进行所述组织的固定。
[0010]更优选地，所述固定的时间为12
‑
72h。
[0011]优选地，所述荧光染料包括羧基荧光素CF、花菁染料Cy3、花菁染料Cy5、花菁染料Cy5.5、花菁染料Cy7、花菁染料Cy7.5、IRDye680RD、IRDye800CW、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 647或Alexa Fluor 680。上述荧光染料的激发
光和发射光波长范围在300
‑
1000nm以内。
[0012]更优选地，所述荧光染料为花菁染料Cy3或花菁染料Cy5。
[0013]优选地，所述脱钙的方法选自EDTA脱钙法或酸性试剂脱钙法。
[0014]更优选地，所述酸性试剂包括甲酸或乙酸。
[0015]优选地，所述胶原杂交肽为(GfO)
n
或(GPO)
n
，n的取值为6、7、8、9、10；其中，f为4
‑
氟代脯氨酸，G为甘氨酸，O为羟脯氨酸，P为脯氨酸。
[0016]更优选地，所述胶原杂交肽为所述胶原杂交肽为(GfO)9或(GPO)9。(GfO)9的序列为GfO GfOGfOGfOGfOGfOGfOGfOGfO；(GPO)9的序列为GPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGPOGP O。
[0017]优选地，所述切片的方法选自冷冻切片或石蜡切片。
[0018]更优选地，所述切片的方法选自冷冻切片。
[0019]优选地，步骤(5)和步骤(6)之间还包括以下一种或多种染色或标记操作：对细胞核进行荧光染色或标记、对生物素的基于标记的链霉亲和素的荧光染色和组织化学染色。
[0020]相对于现有技术，本专利技术的有益效果如下：
[0021]本专利技术所提出的染色方法能够对骨和软骨中打开的胶原三螺旋结构(解旋胶原)进行特异性的甄别和精确地定量分析，以很好地区分和辨识骨和软骨组织中的完整胶原和解旋胶原，从而更客观、更准确地评价骨组织和软骨组织中的胶原分子结构变化。
附图说明
[0022]图1为采用传统CHP染色方法对正常小鼠膝关节和脊柱的染色结果。
[0023]图2为没有脱钙步骤(左列)和采用了两种不同方式脱钙后(中、右两列)用Cy3标记的CHP(Cy3
‑
(GfO)9)染色的正常大鼠股骨骨组织片的荧光图像。
[0024]图3为传统方法处理骨组织切片并进行荧光CHP染色，以及实施例1中方法对骨组织进行荧光CHP染色再脱钙切片的流程比较，以及上述两种方法对同一只正常小鼠两侧膝关节的染色结果的比较(*为骨基质区域，箭头为软骨)。
[0025]图4为分别采用H&E染色方法和实施例1中染色方法，使用Cy3
‑
(GfO)9对胫骨骨折术后3周小鼠模型胫骨的染色结果(箭头：骨折断面)。
[0026]图5为分别采用番红固绿染色方法和实施例1中染色方法，使用Cy3
‑
(GfO)9对骨关节炎(OA)小鼠模型的骨关节炎侧和对照侧膝关节的染色结果。
[0027]图6为采用实施例1中染色方法，使用Cy3
‑
(GPO)9对椎间盘穿刺小鼠的穿刺节段椎间盘和相邻对照非穿刺节段椎间盘的染色结果。
[0028]图7为采用实施例1中(1)
‑
(3)染色方法，使用羧基荧光素CF/花菁染料Cy3/花菁染料Cy5/花菁染料Cy7/花菁染料Cy7.5/IRDye680RD/IRDye800CW
‑
CHP对正常脊柱椎间盘(箭头)样本的染色结果。
具体实施方式
[0029]为了让本领域技术人员更加清楚明白本专利技术所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本专利技术的优选实施例，对本专利技术要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本专利技术的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本专利技术的保护范围内。
[0030]以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
[0031]使用CHP对传统方法获得的骨和软骨病理切片中的解旋胶原的成像检测方法
[0032]取正常小鼠的膝关节和脊柱，先采用传统的病理学方法，再用荧光标记的CHP对切片进行染色成像的方法对进行解旋胶原的检测，步骤如下：
[0033](1)取小鼠的膝关节和脊柱组织样本，去除骨周围肌肉组织，1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种骨和软骨中解旋胶原的染色方法，其特征在于，依次包括以下步骤：(1)组织的固定；(2)采用荧光染料或生物素标记的胶原杂交肽进行染色；(3)脱钙；(4)切片；(5)成像。2.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，步骤(1)中进行组织的固定后还包括对组织进行切开的步骤。3.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，采用多聚甲醛或福尔马林进行所述组织的固定。4.根据权利要求3所述的染色方法，其特征在于，所述固定的时间为12
‑
72h。5.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，所述荧光染料包括羧基荧光素CF、花菁染料Cy3、花菁染料Cy5、花菁染料Cy5.5、花菁染料Cy7、花菁染料Cy7.5、IRDye680RD、IRDye800CW、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李旸，黄馗，刘珊珊，赵素文，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：