新型的α螺旋双性细胞穿透肽及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种新型的α螺旋双性细胞穿透肽及其用途。本发明专利技术的细胞穿透肽具有纳米颗粒自组装的特性，在真核细胞中，在纳摩尔浓度下穿透到细胞中，能够有效地用于将难以穿透细胞的药物等递送到细胞内。胞的药物等递送到细胞内。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型的
α
螺旋双性细胞穿透肽及其用途


[0001]本专利技术涉及一种新型的α螺旋双性细胞穿透肽及其用途。本专利技术的细胞穿透肽具有纳米颗粒自组装的特性，在真核细胞中，在纳摩尔浓度下穿透到细胞中，能够有效地用于将难以穿透细胞的药物等递送到细胞内。
[0002]
技术介绍

[0003]细胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides；“CPP”)是以用于将难以穿透细胞的调节物质，尤其生物药物递送到细胞内的目的而使用的。此时，调节物质能够通过共价键连接于CPP或者与细胞穿透肽构成复合体(complex)。若利用CPP，则在低浓度下也能够递送单独时仅能够在高浓度下细胞内递送的调节物质。
[0004]自20世纪80年代Tat肽作为最初的CPP报道以来，已开发出几十种CPP，并且已阐明利用其能够将低分子调节物质或荧光物质等递送到细胞内的事实。但是，实际上为了将疾病的治疗剂递送到细胞内以提高治疗效果而利用CPP的例子非常罕见。这是因为，至今为止已知的CPP的细胞穿透能力在微摩尔以上的比较高浓度下显示出，该浓度与在活体(或细胞)内能够得到纳摩尔的效果的治疗剂相比非常高的浓度。即，若在微摩尔以上的高浓度下将治疗剂递送到细胞内，则有可能出现严重的由通常具有纳摩尔单位的结合力的治疗剂引起的毒性。而且，CPP本身也有可能具有毒性，因此将微摩尔以上的细胞穿透肽在商业上适用于活体内存在着各种问题。
[0005]本专利技术人在先前的研究中确认到如下事实：若将在特定氨基酸位置包含共价键连接部位的肽制造成二聚体以最大化α螺旋，则细胞穿透性明显提高，即使在纳摩尔浓度下也能够递送到细胞内(WO2015/057009)。尤其阐明了如下特征：当在由Leu和Lys构成的两性的α螺旋肽(LK
‑
1)的疏水性面的i和i+7位置处将亮氨酸取代为半胱氨酸(LK
‑
2)时，会形成在半胱氨酸的氧化条件下形成两个二硫键的二聚体肽(LK
‑
3)，LK
‑
3即使在几纳摩尔浓度下也具有细胞穿透能力。但是，LK
‑
3为单体由共16个氨基酸构成的二聚体束肽(bundle peptide)，其由于制造过程慢，细胞毒性并不令人满意等而不适合在商业上利用。
[0006]仍要求显示出优异的细胞穿透能力并且细胞毒性最小化的CPP。
[0007]
技术实现思路

专利技术要解决的技术课题
[0008]本专利技术欲提供一种考虑到细胞穿透能力、制造过程的简化、二聚体肽对水的溶解度等物质特性、细胞毒性的观点而能够在商业上实际使用的细胞穿透肽。
[0009]本专利技术还欲提供一种利用所述细胞穿透肽能够将生物活性物质例如治疗药物递送到细胞内的平台技术。
[0010]用于解决技术课题的手段
[0011]本专利技术提供一种二聚体肽，其包含由下述化学式1表示的肽作为单体。
[0012]＜化学式1＞
[0013]X1X2X3X4X5X6X7X8X9X
10
[0014][0015]X1、X4、X5及X8分别独立地为疏水性氨基酸，
[0016]X3、X6、X7及X
10
分别独立地为亲水性氨基酸，
[0017]X2及X9分别独立地为以能够使各单体肽在X2及X9中的至少一个位置处彼此连接而形成二聚体肽的方式形成键的氨基酸。
[0018][0019]本专利技术还提供一种制药组合物，其包含所述二聚体肽及生物活性物质。
[0020]专利技术效果
[0021]基于本专利技术的α螺旋两性肽显示出高细胞穿透能力作为纳米颗粒自组装的特征。因此，本专利技术的肽不仅能够将各种生物活性物质有效地递送到细胞内，在穿透细胞之后还能够将细胞毒性最小化，因此能够在疾病的预防或治疗领域中有效地使用。
[0022]并且，本专利技术的二聚体肽由于由单体的形成速度快，在经济方面也有用，适合在商业上使用。
[0023]附图说明
[0024]图1示出基于单体长度变化的二聚体细胞穿透肽的形成速度(以单体的浓度变化来测定)及速度常数k值。
[0025]图2a示出各种二聚体细胞穿透肽的形成速度(以单体的浓度变化来测定)。在各图表中，在第24小时的Monomer concentration(％)以FK10、LK10、FR10、IR10、LR10、IK10、NpgR10、LH10、VK10、FH10、NpgK10的顺序降低(其中，FR10、IR10、LR10在第8小时之后图表几乎重叠)。
[0026]图2b示出具有纳米颗粒自组装的特征的二聚体肽的图式结构。
[0027]图3示出在二聚体中单体间隔的变形的图式化：a)16
‑
mer(LK
‑
3)二聚体；b)10
‑
mer二聚体。
[0028]图4示出本专利技术的二聚体肽的细胞穿透能力。a)检测到荧光的细胞的百分比(％)。在肽浓度约15nM下，细胞百分比(％)以R9(对照组)、diFK10、diLK10、diIK10、diFR10、diLR10、diIR10、diNpgK10、diNpgR10、diChaK10的顺序降低。b)～e)在相同的浓度(62.5nM)下的平均荧光强度的比较。b)示出将diFH10的荧光强度设为1时的相对荧光强度。
[0029]图5示出本专利技术的二聚体肽的细胞毒性(以cell viability来测定)。
[0030]图6a示出本专利技术的二聚体肽的细胞穿透能力与细胞毒性的相关关系。
[0031]图6b以利用反相色谱的每个温度的保留时间的状态变化示出本专利技术的二聚体肽的纳米颗粒自组装的倾向(在各图表的最高温度(Temp)下，ΔRt值以AcLR10 mono、diFR10、
diLR10、LK03、helix A、diLK10(与helix A几乎重叠)、diNpgR10、diNpgK10的顺序降低)。
[0032]图6c示出本专利技术的二聚体肽的纳米颗粒自组装的倾向与细胞毒性的相关关系。
[0033]图7示出Parallel或antiparallel diLK10二聚体的合成及各二聚体的细胞穿透能力。
[0034]图8示出利用与细胞穿透肽的非共价键的环孢素的细胞内递送程度被荧光标记的环孢素来确认的结果值。
[0035]图9示出利用链霉亲和素与生物素结合而成的细胞穿透肽的抗体的细胞内递送。
[0036]具体实施方式
[0037]α螺旋双性细胞穿透肽
[0038]本专利技术提供一种包含由共10个氨基酸构成的10
‑
mer肽作为单体的二聚体形态的细胞穿透肽。所述10
‑
mer单体肽可以以适当的比例(例如1:1，更具体而言，各4个)包含疏水性氨基酸及亲水性氨基酸，各单体能够在1个或2个位置处彼此通过键连接而形成二聚体肽。
[0039]本专利技术人等考虑到二聚体形成速度、细胞穿透能力及细胞毒性、纳米颗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种二聚体肽，其包含由下述化学式1表示的肽作为单体，＜化学式1＞X1X2X3X4X5X6X7X8X9X
10
X1、X4、X5及X8分别独立地为疏水性氨基酸，X3、X6、X7及X
10
分别独立地为亲水性氨基酸，X2及X9分别独立地为以能够使各单体肽在X2及X9中的至少一个位置处彼此连接而形成二聚体肽的方式形成键的氨基酸，X1为N
‑
末端，X
10
为C
‑
末端。2.根据权利要求1所述的二聚物肽，其中，X1、X4、X5及X8分别独立地为选自由亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯基丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、去甲缬氨酸(norV)、色氨酸(W)、戊基甘氨酸(pg)、新戊基甘氨酸(Npg)及环己基丙氨酸(Cha)组成的组中的疏水性氨基酸。3.根据权利要求1所述的二聚物肽，其中，X3、X6、X7及X
10
分别独立地为选自由赖氨酸(K)、精氨酸(R)、高精氨酸(hR)、去甲精氨酸(norR)、组氨酸(H)、鸟氨酸(O)、二氨基丁酸(Dab)及二氨基丙酸(Dap)组成的组中的亲水性氨基酸。4.根据权利要求1所述的二聚物肽，其中，X2及X9分别独立地为选自由半胱氨酸(C)、高半胱氨酸(Hcy)、青霉胺(Pen)、硒代半胱氨酸(Sec，U)及亮氨酸(L)组成的组中的氨基酸，其中，X2及X9不同时为亮氨酸(L)。5.根据权利要求1所述的二聚物肽，其中，在X2及X9中的至少一个位置处形成于各单体肽之间的键为共价键。6.根据权利要求5所述的二聚物肽，其中，所述共价键为选自由二硫键、联硒化物键、酯键、马来酰亚胺键、硫酯键、硫醚键及由点击反应(click reaction)形成的键组成的组中的一个以上。7.根据权利要求5所述的二聚物肽，其特征在于，所述共价键为选自由半胱氨酸(C)、高半胱氨酸(Hcy)或青霉胺(Pen)之间的二硫键、硒代半胱氨酸(See，U)之间的联硒化物键、酯键、利用能够参与反应的硫醇功能基团的马来酰亚胺键、硫酯键、硫醚键及当包含具有能够诱发点击反应的三键或叠氮基的非天然氨基酸时由点击反应(click reaction)形成的键组成的组中的一个以上。8.根据权利要求1所述的二聚物肽，其中，在X1的位置处结合有C6至C
12
脂肪酸。9.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞载勋，玄纯实，曹济仁，金东佑，
申请(专利权)人：坎普疗法有限公司，
类型：发明
国别省市：