检测结核分枝杆菌gyrA氟喹诺酮耐药相关基因突变的crRNA、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了检测结核分枝杆菌gyrA氟喹诺酮耐药相关基因突变的crRNA、试剂盒及检测方法。所述crRNA中的间隔序列(spacer)包含SEQ ID No.1至SEQ ID No.13中任一条所示序列。通过在crRNA分子中的间隔序列上引入碱基错配，实现高特异性、快速检测结核分枝杆菌gyrA基因氟喹诺酮耐药相关突变。氟喹诺酮耐药相关突变。氟喹诺酮耐药相关突变。

【技术实现步骤摘要】
检测结核分枝杆菌gyrA氟喹诺酮耐药相关基因突变的crRNA、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及检测结核分枝杆菌gyrA氟喹诺酮耐药相关基因突变的crRNA、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器。结核病是危害性非常严重的传染病之一，也是死亡率非常高的传染性疾病。据WHO估算，全球结核潜伏感染人群约17亿，占全人群的1/4左右。每年新发病例基本达到800
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1000万。WHO 2008年报道显示，全球结核病总耐药率为20.0％，耐多药率为5.3％，估计全球耐多药结核病为50万例。
[0003]喹诺酮类药物，属化学合成抗菌药。喹诺酮类以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶，妨碍DNA回旋酶，进一步造成细菌DNA的不可逆损害，达到抗菌效果。含氟的新喹诺酮类药，通称为氟喹诺酮类，常用药物有环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、司帕沙星、加替沙星等。氟喹诺酮类药物表现出良好的抗结核分枝杆菌的活性，但结核分枝杆菌对氟喹诺酮类耐药性也逐渐增加。研究表明，结核分枝杆菌编码DNA旋转酶的gyrA基因的喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)发生突变是结核分枝杆菌产生氟喹诺酮类耐药的主要机制。与氟喹诺酮类药物耐药有关的最常见突变位点有GyrA第88位、第90位、第91位以及第94位。
[0004]对结核分枝杆菌耐氟喹诺酮类耐药相关突变的检测方法包括基因测序法(DNAsequencing)、实时荧光定量PCR法(real time PCR)以及芯片杂交法等(DNAchip)等。已有的方法对突变的检测都需要较大型仪器、成本较高且耗费时间较长。
[0005]Zhang Feng与Collinis课题组合作报道了基于CRISPR
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Cas13a的高灵敏度核酸分子检测工具包，他们称这种工具为SHERLOCK(Specific High
‑
sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)。该系统除包含Cas13a以及靶向待检测靶标的crRNA外，还包括一个被切割后可释放荧光的RNA探针。crRNA由固定的直接重复序列(direct repeat)以及靶标特异性的间隔序列(spacer)组成。Cas13a在crRNA的引导下识别与切割靶RNA后，Cas13a表现出非特异性的RNA酶活性，发挥附带效应继续切割RNA荧光探针，释放荧光信号。Zhang Feng课题组在该工具的研发中，还借助了一种等温扩增方法—重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification)进行核酸的扩增，可以使该工具的检测下限可达到单分子级别，与数字PCR(digital droplet PCR,ddPCR)以及定量荧光PCR(quantitative PCR，qPCR)具有相似的灵敏度，且具有更低的变异度。现有的文献报道中，CRISPR
‑
Cas13a系统主要被用于检测是否存在特定的核酸片段，尚未将该系统用于鉴定特定核酸片段中是否有特定的突变位点。
[0006]基于此，提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌gyrA氟喹诺酮耐药相关基因突变
的crRNA、试剂盒及检测方法。通过在所设计的crRNA分子上引入碱基错配，实现高特异性、快速检测结核分枝杆菌gyrA基因突变，可用于检测因单个碱基的突变引起的结核杆菌耐药突变，例如氟喹诺酮耐药突变。
[0008]本专利技术提供的技术方案如下：
[0009]一种检测结核分枝杆菌gyrA氟喹诺酮耐药相关基因突变的crRNA，所述crRNA的间隔序列包含SEQ ID No.1至SEQ ID No.13任一条所示序列。
[0010]专利技术人提出通过优化crRNA中间隔序列中错配碱基的数量以及位置，使crRNA能差异性引导Cas13a识别野生型以及突变型序列，释放显著差异的RNA酶活性，实现对单核苷酸突变的检测，并使用结核分枝杆菌gyrA中氟喹诺酮耐受相关突变作为检测靶标，展示了一套可以区分野生型序列与突变型序列的crRNA。
[0011]在一个实施方案中，所述crRNA用于检测结核分枝杆菌gyrA基因的点突变；
[0012]优选地，所述点突变为造成gyrA第88、90、91、94位氨基酸改变的单碱基替换。
[0013]一种CRISPR
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Cas13a系统，包括前述任一所述的crRNA。
[0014]在一个实施方案中，所述CRISPR
‑
Cas13a系统还包括能够表达Cas13a蛋白的质粒、信号报告探针以及核酸酶缓冲液。
[0015]在一个实施方案中，所述Cas13a蛋白选自LwCas13a或LshCas13a；优选地，所述Cas13a蛋白为LwCas13a。
[0016]所述crRNA或所述CRISPR
‑
Cas13a系统在结核分枝杆菌gyrA基因突变检测中的应用；
[0017]优选地，所述应用为用于结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测；所述应用为非疾病诊断目的。
[0018]一种试剂盒，所述试剂盒含有所述crRNA；优选地，所述试剂盒用于检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变。
[0019]一种非疾病诊断目的的结核分枝杆菌gyrA基因突变的检测方法，所述方法包括：
[0020]获得待测样本RNA；
[0021]将所述crRNA与所述样本RNA、LwCas13a蛋白以及荧光标记探针和RNA酶抑制剂在核酸酶缓冲液体系中孵育后进行检测。
[0022]在一个实施方案中，在所述核酸酶缓冲液体系孵育后，加入到胶体金试纸条样品检测区进行检测或者将所述体系孵育后荧光检测仪测定荧光值；优选地，在酶标仪上每隔1～2min检测一次荧光。
[0023]在一个实施方案中，所述体系中的各组分含量为：LwCas13a 400
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500nM；crRNA800
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1000nM；样本RNA1600
‑
2000nM；荧光标记探针120
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200nM；优选地；LwCas13a 450nM；crRNA900nM；样本RNA1800nM；荧光标记探针120nM。
[0024]在本专利技术的一个具体实施方案中，所述荧光标记探针的序列的5
’
端标记有荧光基团，3
’
端标记有淬灭基团。所述荧光标记探针被激活的LwCas13a非特异的RNA酶剪切，并释放荧光信号。
[0025]所述crRNA与基因gyrA的突变型ssRNA形成单碱基错配，与目标基因的野生型ssRNA形成双碱基错配。
[0026]所述crRNA识别其针对的突变型基因靶标ssRNA，Cas13a蛋白在设定的crRNA引导
下，与对应的含突变位点的s本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测结核分枝杆菌gyrA氟喹诺酮耐药基因突变的crRNA，其特征在于，所述crRNA的间隔序列包含SEQ ID No.1至SEQ ID No.13中任一条所示序列。2.根据权利要求1所述的crRNA，其特征在于，所述crRNA用于检测结核分枝杆菌gyrA基因的点突变；优选地，所述点突变为造成GyrA第88、90、91、94位氨基酸改变的单碱基替换。3.一种CRISPR
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Cas13a系统，其特征在于，包括如权利要求1所述的crRNA。4.根据权利要求3所述的CRISPR
‑
Cas13a系统，其特征在于，还包括能够表达Cas13a蛋白的质粒、信号报告探针以及核酸酶缓冲液。5.根据权利要求4所述的CRISPR
‑
Cas13a系统，其特征在于，所述Cas13a蛋白选自LwCas13a或LshCas13a；优选地，所述Cas13a蛋白为LwCas13a。6.权利要求1或2所述的crRNA或权利要求3～5任一项所述CRISPR
‑
Cas13a系统在结核分枝杆菌gyrA基因突变检测中的应用；...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙泉鑫，黄爱龙，白晓鹏，高攀淇，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：