鹿茸由RBPMS介导的microRNA及其应用制造技术

鹿茸由RBPMS介导的microRNA及其应用，它涉及一种小RNA(microRNA)，本发明专利技术提供了来源于东北马鹿(Cervus elaphus)鹿茸茸皮并对细胞迁移和增殖起促进作用的因子，其命名为：microRNA PC

【技术实现步骤摘要】
鹿茸由RBPMS介导的microRNA及其应用


[0001]本专利技术涉及一种小RNA(microRNA)，调控细胞的迁移和增值。

技术介绍

[0002]在哺乳动物中，只有鹿茸角是目前所知唯一的具有表形态再生能力的器官，即在失去后还能完全再生出来。在再生周期里，鹿茸从顶部生长点平均每天延伸1
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2cm，又会在近百天的快速生长后最终自动停止，茸性皮肤会慢慢死亡脱落。鹿茸角再生机理很复杂，目前仍然是再生生物学领域的重要研究模型。
[0003]MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度为18
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24个核苷酸、重要的基因表达的负调控因子，通过调节目标基因mRNA稳定性或翻译效率来表现其功能。其来源于长的具有发卡样二级结构的转录子，并被两种核酸内切酶Drosha和Dicer剪切，形成双链的miRNA。其中一条链形成成熟的miRNA，另一条链降解。成熟miRNA通过与靶标基因mRNA的3
’
非翻译区(Untranslated Regions，UTR)目标位点结合而对其进行调控。一个miRNA的选择性活性依赖于与这个同源mRNA互补的miRNA的种子序列(seed region)(图1所示)。因为miRNA 种子内的不完美碱基配对代表这个核心5
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7核苷酸序列可以潜在地结合很多mRNA序列，一个miRNA可同时调控多个目标基因的mRNA。研究表明miRNA在很多细胞的增殖、分化、器官形态发生和肿瘤发生等生物学过程中起非常关键的调节作用。miRNA通过抑制目标基因起到癌基因或肿瘤抑制的作用，目前，越来越多的miRNA被证明在癌症发生和发展过程中发挥非常重要的作用，所以miRNA可以作为治疗癌症的潜在新靶标。
[0004]具有多重剪接的RNA结合蛋白(RNA Binding Protein With Multiple Splicing，RBPMS，又名Hermes)基因是一个编码蛋白的基因，位于人类染色体8p11
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12。该基因编码的蛋白质是具有单个RNA识别基序(RRM)的保守RNA结合蛋白，长度80
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100个氨基酸，由两个较短的保守序列以及一些高度保守的疏水残基组成。目前，关于RBPMS的功能研究较少，但RRM家族的蛋白质大多在mRNA预处理(剪接，加帽和多聚腺苷酸化)，RNA稳定性，转运，定位和 mRNA翻译调控方面具有重要作用。同时，也有少量研究表明，RBPMS可通过抑制某些癌基因(例如MYC和抗凋亡蛋白Bcl
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2)或激活细胞周期抑制剂(包括p15INK4b，p21CIP1/WAF1 和p57KIP2)来阻滞细胞周期进程，从而导致细胞周期停滞或细胞凋亡。

技术实现思路

[0005]本专利技术确定了东北马鹿(Cervus elaphus)鹿茸茸皮来源的，通过靶向调控RBPMS促进细胞增殖，迁移的正调控因子，并确定这种因子的名称、序列。本专利技术从马鹿鹿茸茸皮组织的microRNA数据库中筛选得到的microRNA PC
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3p
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40996(以下简称PC
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40996)，是一种在鹿茸茸皮中特异性表达的miRNA，长度22nt。序列如SEQ ID NO：1所示 (UGAACAGCAGUUGAACAUGGGU)。
[0006]本专利技术经过293T细胞的Western Blotting、双荧光素酶报告实验和MCF
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7细胞的Woundhealing assays、CCK8细胞增殖检测等实验证明了PC
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40996能够直接靶向调控
RBPMS的表达 (图2、3所示)，并促进细胞迁移和增殖(图4、5所示)。
[0007]本专利技术包含以下有益效果：
[0008]作为基因表达的负调控因子，microRNA在细胞生长、器官发育、个体生长及各种疾病的进程中都起到非常重要的作用。从快速生长的鹿茸顶端茸皮组织中分离出来的microRNA对鹿茸的再生生长会起非常重要的调控作用。
[0009]因此，本专利技术从快速生长期的新生马鹿鹿茸顶端茸皮组织microRNA测序结果中得到一个 miRNA PC
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40996，其转录前体长约95nt，可形成发卡结构，成熟miRNA全长22nt，在miRBase 数据库(Release 22.1)中无同源序列。BLAST结果显示，无论是成熟miRNA全长还是其seed 序列，在人、黑猩猩、猕猴、小鼠、大鼠、豚鼠、鼩鼱、狗、猫、马、牛等模式物种基因组中均无同源序列。
[0010]通过TargetScan预测鹿茸茸皮发育的关键性因子RBPMS是PC
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40996的靶基因之一，通过 293T和MCF
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7细胞中进行的Western Blotting、双荧光素酶报告实验、Wound healing assays(细胞划痕实验)和CCK8细胞增殖检测等实验，确定了PC
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40996对RBPMS具有直接靶向作用(实验结果如图2、3所示)，并能促进MCF
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7细胞的迁移和增殖(实验结果如图4、5所示)。
[0011]本专利技术筛选的基因序列如下：
[0012]名称：microRNA PC
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3p
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40996
[0013]序列：UGAACAGCAGUUGAACAUGGGU。
附图说明
[0014]图1为多种模式生物RBPMS mRNA 3
’
UTR区具有与潜在PC
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40996seed序列(小写序列) 互补结合的保守位点(大写加下划线序列)。
[0015]图2为将野生型重组表达载体PSI
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CHECK2
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RBPMS 3
’
UTR
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WT和突变型重组表达载体PSI
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CHECK2
‑
RBPMS 3
’
UTR
‑
MUT与miRNA PC
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40996mimics或NC共转染入293T细胞中所得到的双荧光素酶实验结果。Firefly Luciferase作为内参。如图所示，与NC+RBPMS
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WT 组相比，40996+RBPMS
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WT组(WT
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RBPMS)的相对Renilla荧光素酶活性显著性下降；与 40996+RBPMS
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WT组相比，40996+RBPMS
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MUT组(MUT
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RBPMS)的相对Renilla荧光素酶活性显著性上升。这正反回复的变化趋势充分说明了miRNA PC
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40996与RBPMS之间存在直接靶向调控关系。
[0016]图3为miRNA PC
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鹿茸由RBPMS介导的microRNA，其特征在于它命名为：microRNA PC
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3p
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40996，其序列为UGAACAGCAGUUGAACAUGGGU。2.鹿茸由RBPMS介导的m...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑冬，刘学东，姚茂林，付蓝仪，吴尽，杨帆，裴欣，杨天雄，吴玄烨，武世瑶，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：